MiR-181c對耐順鉑鼻咽癌細胞凋亡的作用及其機制.pdf

1、目的：
　　1.驗證耐藥鼻咽癌細胞HNE1/DDP的耐藥性。
　　2.檢測鼻咽癌細胞HNE1/DDP和HNE1中miR-181c表達的差異并且研究其對細胞凋亡的作用。
　　3.探討miRNA影響鼻咽癌細胞凋亡的機制。
　　方法：
　　1.MTT法檢測不同濃度順鉑（DDP）對兩株細胞HNE1和HNE1/DDP的增殖抑制的影響；根據(jù)24、48、72h的IC50值確定耐藥株細胞的耐藥指數(shù)；鼻咽癌細胞HNE1、HN

2、E1/DDP中抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2和促凋亡蛋白Bax和Bim的蛋白表達水平則采用Western blot實驗方法檢測，進一步驗證耐藥株細胞的耐藥性。
　　2.根據(jù)課題組之前的MicroRNA（miRNA）芯片結果篩選出差異表達的miR-181c，并采用熒光定量 RT-PCR方法驗證表達的差異。
　　3.分別將類似物miR-181c mimics、抑制劑miR-181c inhibitors轉染到表達量低的HNE1

3、/DDP和表達量較高的HNE1細胞株中，RT-PCR方法檢測轉染后miR-181c在兩株細胞中的表達情況；MTT法檢測轉染 miR-181c mimics和inhibitors后對兩株細胞增殖抑制的影響；集落克隆、PI單染以及Annexin V/PI雙染法檢測兩株細胞凋亡的變化。
　　4.采用Western blot方法檢測miR-181c的調控對Mcl-1基因在兩株細胞中的表達的影響；轉染Mcl-1 siRNA,集落克隆和Ann

4、exin V/PI雙染法檢測凋亡的變化。
　　結果：
　　1.鼻咽癌細胞HNE1/DDP相對親本細胞HNE1具有耐藥的特性
　　(1) MTT法顯示：在24、48、72h，不同濃度的DDP(2、4、8、16、32μmol·L-1)作用于鼻咽癌細胞HNE1、HNE1/DDP能夠抑制其增殖，且呈時間和濃度依賴性。
　　在24、48、72h，鼻咽癌細胞HNE1/DDP的半數(shù)抑制率(IC50)計算后得出分別為32.15±

5、0.37、21.88±0.49、14.76±0.56μmol·L-1，鼻咽癌細胞HNE1的IC50為7.87±0.33、5.25±0.15、3.45±0.35μmol·L-1。鼻咽癌細胞HNE1/DDP耐藥指數(shù)(RI)計算后得出為4.08、4.16、4.27。從計算得出的IC50以及RI可以看出，耐藥株細胞HNE1/DDP是符合耐藥株的條件的，耐藥株的耐藥性得以驗證。
　　(2) Western blot和熒光定量PCR結果同時顯

6、示：在耐藥株HNE1/DDP細胞中，抗凋亡蛋白以及抗凋亡基因 MRP、Bcl-2表達升高，促凋亡蛋白和促凋亡基因Bax、Bim表達下降。
　　2.miR-181c在HNE1和HNE1/DDP中的表達具有差異
　　課題組前期的miRNA芯片結果顯示，miR-181c在兩株細胞中的表達具有差異，我們采用熒光定量RT-PCR驗證結果顯示，在HNE1中，miR-181c具有3.5倍的上調。
　　3.miR-181c的調控對鼻咽

7、癌細胞凋亡的影響
　　(1)在低表達miR-181c的HNE1/DDP細胞中，轉染miR-181c的模擬物使其表達增加，相反地，在高表達miR-181c的HNE1細胞中，轉染miR-181c抑制劑使其表達減少。轉染之后，采用熒光定量RT-PCR再次檢測兩株細胞中的表達情況，結果證明，miR-181c類似物可以使細胞中miR-181c的表達增加，而miR-181c抑制劑則降低miR-181c的表達。
　　(2) MTT結果顯示

8、，miR-181c抑制劑能明顯增強HNE1細胞耐順鉑能力，miR-181c模擬物降低 HNE1/DDP細胞對順鉑的耐受力。此外，集落克隆、PI單染以及Annexin V/PI雙染法結果均顯示，miR-181c抑制劑能明顯降低順鉑作用 HNE1細胞的凋亡率，miR-181c模擬物增加了順鉑作用于HNE1/DDP細胞的凋亡率。
　　4.miR-181c通過作用于Mcl-1對鼻咽癌細胞的凋亡產(chǎn)生影響
　　(1) Western b

9、lot結果顯示，HNE1/DDP細胞中Mcl-1的表達明顯高于HNE1細胞。
　　(2) Western blot結果顯示，miR-181c抑制劑能使 HNE1細胞中 Mcl-1增加，miR-181c模擬物能使HNE1/DDP細胞中Mcl-1降低。
　　(3)將Mcl-1 siRNA、陰性對照siRNA轉染進鼻咽癌細胞HNE1/DDP中，western blot和qRT-PCR檢測Mcl-1表達減少，證明成功干擾了Mcl-1

10、的表達。集落克隆結果可以看出，干擾了Mcl-1的表達后能減少HNE1/DDP細胞集落的形成。此外，PI單染和Annexin V/PI雙染法結果表明，干擾Mcl-1的表達后能增加順鉑誘導的HNE1/DDP細胞的凋亡率。
　　結論：
　　1.HNE1/DDP較親本細胞HNE1具有耐藥的特性。
　　2. HNE1和HNE1/DDP細胞中miR-181c的表達是不同的，降低miR-181c的表達以后可以降低HNE1細胞由順鉑誘