TIGAR對(duì)鼻咽癌細(xì)胞自噬、凋亡及線粒體降解作用研究.pdf

1、目的：探討TIGAR(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator)基因沉默后對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞自噬、凋亡、線粒體降解及線粒體形態(tài)、功能的影響。
　　方法：1、體外培養(yǎng)鼻咽癌5-8F細(xì)胞系;通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的特異性shRNA干擾TIGAR表達(dá)，并通過(guò)免疫熒光分析、Western blot檢測(cè)TIGAR在胞質(zhì)及線粒體內(nèi)表達(dá)水平變化;2、流式細(xì)胞儀分析沉默TIGAR基因后細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物

2、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)及活性氧(ROS)含量變化，評(píng)估細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平;3、Western blot檢測(cè)主要的細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1及P62表達(dá)水平變化，分析細(xì)胞自噬活性變化;4、JC-1染色細(xì)胞檢測(cè)線粒體膜電位變化;5、分離細(xì)胞質(zhì)蛋白及線粒體蛋白通過(guò)Western blot檢測(cè)凋亡蛋白細(xì)胞色素c在線粒體與胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)水平變化;流式分析檢測(cè)Annexin V/PI染色細(xì)胞凋亡率;6、Wes

3、tern blot檢測(cè)線粒體自噬蛋白PINK1及Parkin表達(dá)水平變化;線粒體綠色熒光探針標(biāo)記線粒體，通過(guò)流式分析線粒體數(shù)量變化，Western blot驗(yàn)證線粒體管家基因編碼的蛋白——mtHSP70表達(dá)水平變化，分析細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量變化;7、電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，特別是線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化;高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量變化，評(píng)估線粒體功能。
　　結(jié)果：1、通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞，成功構(gòu)建TIGAR基

4、因沉默的細(xì)胞株(sh TIGAR)及對(duì)照組細(xì)胞株(sh scramble)，Western blot及免疫熒光分析均顯示在干擾組細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體內(nèi)TIGAR表達(dá)水平明顯降低;2、TIGAR干擾導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NADPH產(chǎn)生減少，細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)比例降低，ROS水平明顯升高，細(xì)胞氧化還原狀態(tài)改變;3、干擾組細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表達(dá)顯著上升，同時(shí)P62表達(dá)下降，表明細(xì)胞

5、自噬增強(qiáng);4、沉默TIGAR引起細(xì)胞線粒體膜電位下降;5、干擾組細(xì)胞中細(xì)胞色素c在胞質(zhì)內(nèi)含量明顯增加而在線粒體內(nèi)含量減少，且干擾組細(xì)胞凋亡率明顯升高，表明細(xì)胞凋亡增加;6、沉默TIGAR后，細(xì)胞胞質(zhì)中PINK1水平上升，線粒體內(nèi)Parkin表達(dá)增加，表明PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)的線粒體自噬被激活，但干擾組細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量卻較對(duì)照組細(xì)胞增多;7、電鏡下觀察到TIGAR干擾組細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)出腫脹，脊瓦解，空泡形成的異常形態(tài)，同時(shí)高效

6、液相檢測(cè)顯示干擾組細(xì)胞內(nèi)ATP生產(chǎn)較對(duì)照組細(xì)胞減少，表明線粒體的結(jié)構(gòu)與功能完整性遭到破壞。
　　結(jié)論：沉默TIGAR后5-8F細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG比例降低，ROS積聚，使細(xì)胞不能維持正常的氧化還原狀態(tài)，氧化應(yīng)激增加，細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率上升，線粒體膜電位降低，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP)開放，使PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬途徑被激活，但最終線粒體降解被阻礙，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)受損線粒體堆積，表現(xiàn)為線粒體結(jié)構(gòu)紊亂及