產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌的構(gòu)建和發(fā)酵性能研究.pdf

1、琥珀酸是一種重要的化工產(chǎn)品,廣泛應用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥及精細化工等領(lǐng)域,市場前景巨大。相比于傳統(tǒng)的化學生產(chǎn)法,微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸具有無可比擬的優(yōu)點和潛力,引起了國內(nèi)外眾多研究機構(gòu)的高度關(guān)注。其中運用基因工程手段構(gòu)建高產(chǎn)琥珀酸的重組大腸桿菌是近年來的研究熱點,由于野生大腸桿菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中琥珀酸含量低,且有大量副產(chǎn)物。要達到高產(chǎn)琥珀酸的目的,就必須為其進行代謝途徑的改造,阻斷代謝支路,引導碳流更快更多的流向目標產(chǎn)物。
　　 本

2、文利用Xer/dif重組酶系統(tǒng),對一株野生大腸桿菌Escherichia coli CICIM B0013開展了代謝途徑的調(diào)控研究。首先為了消除發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雜酸等副產(chǎn)物,本文敲除了E.coli CICIM B0013琥珀酸代謝競爭途徑中包括乙酸激酶和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(ackA-pta)、乳酸脫氫酶基因(ldhA),丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB),乙醇脫氫酶基因(adhE)在內(nèi)的關(guān)鍵酶基因,所得到的重組菌株E.coli B0013

3、-1040具備厭氧條件下高效轉(zhuǎn)化葡萄糖生成琥珀酸的能力,發(fā)酵液中無乙酸,甲酸等副產(chǎn)物生成。
　　 其次本文在琥珀酸代謝支路已被阻斷的大腸桿菌菌株基礎上又進行了葡萄糖吸收方式的調(diào)整研究。為關(guān)閉其葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS),敲除了該系統(tǒng)中關(guān)鍵酶ⅡCBGlc。的編碼基因ptsG,促使半乳糖協(xié)同運輸系統(tǒng)成為大腸桿菌葡萄糖運輸?shù)闹饕緩?。這項改變大大增加了琥珀酸的合成前體PEP,得到的重組菌株E.coli B0013-1050經(jīng)發(fā)酵實

4、驗結(jié)果顯示產(chǎn)琥珀酸能力得到了大幅度提升。厭氧轉(zhuǎn)化36 h琥珀酸產(chǎn)量達到30.5 g/L,生產(chǎn)強度為0.85 g/L·h,葡萄糖.琥珀酸糖酸轉(zhuǎn)化率為65.2％,發(fā)酵液經(jīng)HPLC未檢測到乙酸等雜酸。另外,ptsG基因的缺失也解除了葡萄糖代謝產(chǎn)物對菌體的抑制,使大腸桿菌可以同時利用葡萄糖以外的多種碳源,很大程度上拓寬了琥珀酸發(fā)酵的底物譜,為降低生產(chǎn)成本,大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎。
　　 為加強琥珀酸合成途徑,引導代謝流更多的流向草酰

5、乙酸這一關(guān)鍵節(jié)點,本文強化表達了PEP羧化酶。通過將大腸桿菌內(nèi)源ppc基因與不同拷貝數(shù)質(zhì)粒的連接,導入重組菌,從而使實現(xiàn)對ppc基因在宿主體內(nèi)表達劑量的控制。研究發(fā)現(xiàn)在琥珀酸生產(chǎn)過程中,PEP羧化酶的表達劑量并非越高越好,而是需要控制在一個合理的水平才能有效促進琥珀酸的積累。實驗中得到的重組菌E.coli B0013-1050(pTH-ppc)是所有重組菌中生產(chǎn)能力最強的一株,厭氧轉(zhuǎn)化葡萄糖36 h琥珀酸產(chǎn)量達到36.2 g/L,生產(chǎn)強