重組大腸桿菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的高密度發(fā)酵研究.pdf

1、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(蛋白質(zhì)-谷氨酸-γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,Transglutaminase EC2.3.2.13,TGase),是一種催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶,它以肽鏈中的谷氨酰胺殘基γ-酰胺基作為?；w,當(dāng)酰基受體為多肽中賴氨酸殘基的ε-氨基或伯氨基時(shí),它催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)、蛋白質(zhì)、氨基酸、肽鏈之間的連接;當(dāng)水為?；荏w時(shí),可催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解。由于TGase具有提高各種蛋白的功能特性的巨大潛能,主要應(yīng)用于提高蛋白的

2、質(zhì)地和穩(wěn)定性。
　　本文以大腸桿菌Rosetta(DE3)為研究對(duì)象,以提高菌體濃度為目標(biāo),對(duì)重組菌的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化研究。在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了10L發(fā)酵罐小試,并對(duì)得到的包涵體蛋白進(jìn)行溶解、變性、最終得到具有生物活性的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。
　　為了提高重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的產(chǎn)量,在搖瓶發(fā)酵條件下,采用LB培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌Rosetta(DE3)的生長(zhǎng)及產(chǎn)物表達(dá)進(jìn)行了初步研究,確定了最佳的發(fā)酵條件:搖瓶裝液量

3、為25mL/250mL,接種量為5％,培養(yǎng)溫度為37℃,初始pH7.0,接種4h后(對(duì)數(shù)中期,OD=0.6～0.8)進(jìn)行誘導(dǎo),誘導(dǎo)劑濃度為0.8mmol/L,誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為4h。
　　在上述發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,通過一系列單因子試驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化,最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖4g/L,酵母提取物3g/L,NH4Cl4.0g/L,Na2HPO42.0g/L,KH2PO41.0g/L,MgSO4·7H2O1.0g/

4、L,NaCl3.0g/L,微量元素溶液濃度2.0mL/L,鹽酸硫胺素(VB1)1.0mg/L、核黃素(VB2)0.5mg/L、泛酸(VB5)0.5mg/L、鹽酸吡哆醇(VB6)0.2mg/L。采用此合成培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,最終的OD由1.8提高到5.8左右,重組蛋白的表達(dá)量可達(dá)36.2％。菌體生長(zhǎng)率和菌體濃度都得到大幅度的提高。
　　在以上研究的基礎(chǔ)上,采用溶氧反饋流加補(bǔ)料策略,對(duì)其進(jìn)行10L發(fā)酵小試,最終OD達(dá)到51.5,將發(fā)酵