重組大腸桿菌酶法催化產(chǎn)谷胱甘肽.pdf

1、谷胱甘肽是參與細胞活動的最普遍的非蛋白巰基化合物，是機體內(nèi)重要的活性三肽，因其抗氧化作用而在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)有著廣泛的應用，生物合成是制備谷胱甘肽的主要方法，一直引起廣泛關注。本研究的主要內(nèi)容是克隆表達不同來源的谷胱甘肽合成相關的酶，比較不同重組菌催化產(chǎn)谷胱甘肽的產(chǎn)量，并對新型雙功能谷胱甘肽合成酶進行了相關酶學性質(zhì)的研究，最后通過催化優(yōu)化提高新型重組菌的谷胱甘肽產(chǎn)量。
　　本文將來自E.coliK12的谷胱甘肽合成酶相關基

2、因gshA，gshB和來自Streptococcusthermophilus的雙功能酶基因gshF克隆，構建得到五種重組菌，分別為Rosetta（pET-gshA），Rosetta（pET-gshB），BL21（pET-gshA），BL21（pET-gshB），BL21（pET-gshF），通過在不同宿主菌中表達，在添加前體氨基酸和ATP的條件下，比較得到來自gshF的重組菌酶法產(chǎn)谷胱甘肽的產(chǎn)量比gshA，gshB的兩種混合菌分別高23

3、.8％和5.4％。
　　接著本文將新型雙功能酶GshF在EcoliBL21中表達，并對表達條件做了優(yōu)化。研究表明，重組菌于37℃培養(yǎng)4h后經(jīng)0.1mMIPTG誘導，然后在30℃下表達，胞內(nèi)酶活可達44U/L。表達產(chǎn)物經(jīng)破胞、離心、親和層析等步驟分離純化后，進一步考察了其相關酶學性質(zhì)，結果表明，該酶的最適pH為8.0，最適溫度為37℃，論文還研究了其在最適pH和溫度下的穩(wěn)定性。結果為該酶在37℃條件下，40min內(nèi)降解，pH為8的條

4、件下于4℃保存幾天，酶活幾乎不變，穩(wěn)定性較強。
　　最后本文對新型重組菌BL21(pET-gshF)全細胞催化產(chǎn)谷胱甘肽做了催化條件優(yōu)化。通過優(yōu)化反應初始pH，前體反應物(ATP、Cys)的濃度，得到最佳的酶催化反應條件:100mMKH2PO4buffer(pH8.0),60mMGlu,30mMCys,40mMGly,20mMMgCl2,30mMATP。調(diào)初始反應pH為8.0。最終催化得到谷胱甘肽的產(chǎn)量為2.11g/L。該研究對該