曲霉果膠酶在大腸桿菌中的重組表達(dá)研究.pdf

1、果膠酶具有廣闊的商業(yè)用途，在食品工業(yè)上主要用于果汁和酒類的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纖維脫膠。Aspergillus fungi是生產(chǎn)果膠酶最常用的菌種，一直用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)，自然條件下其果膠酶的產(chǎn)量較低。文獻(xiàn)報(bào)道的果膠酶的重組表達(dá)成功的例子較少，且活性較低。果膠酸裂解酶(pectate lyase)和果膠酸水解酶(poIygaIacturonase)在生物界中來源廣泛，在植物，真菌和細(xì)菌中都有報(bào)道。從一系列不

2、同的植物組織中，如萌發(fā)的種子，花粉，植物細(xì)胞發(fā)酵液，成熟的水果等，研究人員獲得到多種Pectate lyase和poIygaIacturonase基因。Pectate lyase A(PelA)來自于Aspergillus nidulans，polygalacturonase A(PGA)來自于Aspergillus oryzae。本文成功地構(gòu)建了Aspergillus nidulans PelA和Aspergillus oryzae

3、PGA原核高效表達(dá)體系。 通過RT-PCR擴(kuò)增得到不含信號(hào)肽的PelA cDNA，它的序列被連接到DMD 18-T Vector(TaKaRa)，用DNA限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ將不含信號(hào)肽的PelA cDNA從pMD18-T-pelA切下，連到pET-28a(+)表達(dá)載體(Novagen)構(gòu)建pET-28a(+)-pelA，轉(zhuǎn)化E．coli Turner(DE3)plac Ⅰ細(xì)胞(Novagen)。pET-28a(

4、+)-pelA-Turner(DE3)plac Ⅰ重組菌采用0.5mM IPTG誘導(dǎo)，20℃低溫表達(dá)60h，0℃條件下超聲破碎細(xì)胞后離心得到上清，上清用Ni-NTA His-BindResins(Novagen)進(jìn)行一步純化，在50 mM Tris-HCI，pH8.5的緩沖液中進(jìn)行透析。重組酶活力可達(dá)360 UmL<'-1>，是自然條件下產(chǎn)酶量的3600倍。Pel A僅對(duì)果膠酸和30％酯化度的果膠有裂解能力，對(duì)其它細(xì)胞壁多聚物沒有作用。

5、對(duì)果膠的裂解活性隨甲基化程度上升和酸性化程度下降而變小，反之，隨甲基化程度下降和酸性化程度上升而變強(qiáng)。PeIA的最適酶反應(yīng)條件pH 7.5-10，50℃。Mn<'2+>，Ca<'2+>，F(xiàn)e<'2+>，Mg<'2+>和Fe<'3+>對(duì)酶活力有不同程度的激活作用，而Cu<'2+>和Zn<'2+>對(duì)酶活力有部分抑制作用。用不同濃度的果膠酸作底物，檢測(cè)該酶的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)，V<,max>為77 μmol min<'-1>mg<'-1>，K<,m

6、>為0.50 mg mL<'-1>。PelA對(duì)植物組織的嘗試性研究發(fā)現(xiàn)該酶能有效解離綠豆等雙子葉植物組織。同樣通過RT-PCR擴(kuò)增得到不含信號(hào)肽的PGA cDNA，它的序列被連接到pMD 18-T Vector(TaKaRa)，用DNA限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ將不含信號(hào)肽的PGA cDNA從pMD18-T-pelA切下，連到pET-28a(+)表達(dá)載體(Novagen)構(gòu)建pET-28a(+)-pgA，轉(zhuǎn)化E．coli Tu

7、rner(DE3)plac Ⅰ細(xì)胞(Novagen)。轉(zhuǎn)化子pET-28a(+)-pgA-Turner(DE3)plac Ⅰ的構(gòu)建首次實(shí)現(xiàn)了米曲霉PGA在大腸桿菌系統(tǒng)中過表達(dá)，進(jìn)一步對(duì)PGA在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的條件進(jìn)行了研究。在37℃條件，220 rpm，培養(yǎng)pET-28a(+)-pgA-Turner(DE3)plac Ⅰ細(xì)胞，OD600至0.8左右時(shí)，用500 μM isopropyl β-D-thiogaIactogalactop

8、-yranoside(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在15℃和170 rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，表達(dá)效果最好，相對(duì)于每毫升培養(yǎng)基而言，產(chǎn)酶可達(dá)到70 UmL<'-1>，是米曲霉自然條件產(chǎn)酶量的87.5倍，遠(yuǎn)優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的重組表達(dá)的PGA酶活。PGA對(duì)果膠底物的降解能力同Pel A。PGA的最適酶反應(yīng)條件pH 5.0-5.5，50℃，Cu<'2+>和Zn<'2+>對(duì)酶活力有部分抑制作用。PGA對(duì)植物組織的嘗試性研究發(fā)現(xiàn)該酶也能有效解離綠豆等