重組人胰島素在大腸桿菌中的表達(dá)及分離純化.pdf

1、胰島素用于臨床已有80多年的歷史，由于它是治療糖尿病的特效藥物和糖尿病患者在人口中的比例相當(dāng)高，所以對胰島素的需求量一直很大，這就促使人們不斷尋求和探索更加有效的表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)策略。 本實驗室利用基因工程的方法將改造后的人胰島素原基因加載到質(zhì)粒pET<,28>(+)a上，然后將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta<,tm>(DE3)，經(jīng)過菌種選育，獲得了重組人胰島素的高水平表達(dá)，并通過對實驗室搖瓶培養(yǎng)條件的研究，得到了優(yōu)化后的發(fā)酵條

2、件：基因工程大腸桿菌生長2h菌體密度就能達(dá)到OD<,600>值0.8，在此時加入誘導(dǎo)劑效果最好，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.5 mmol/L；誘導(dǎo)4h；誘導(dǎo)溫度為37℃；Kana濃度對菌體蛋白的表達(dá)影響不大，加入30mg/L用以抑制雜菌的生長。 重組人胰島素原在大腸桿菌中表達(dá)時易形成不溶性、無活性的包涵體，因此，必須經(jīng)過體外變性、復(fù)性的過程。為了減少包涵體中的雜質(zhì)對復(fù)性產(chǎn)生的影響，需要在復(fù)性前對菌體及包涵體進(jìn)行洗滌，實驗對含有不同

3、尿素濃度的洗滌液進(jìn)行試驗比較，最后選定用含2 mol/L尿素的包涵體洗滌緩沖液對包涵體進(jìn)行洗滌3次。通過對變性液中DTT濃度、復(fù)性液中氧化還原對條件、pH值、小分子添加劑以及復(fù)性方式等多種因素進(jìn)行的研究，得出了包涵體目的蛋白變性液的優(yōu)化復(fù)性條件：DTT濃度為60mmol/L，GSSG濃度為0.2mmol/L，GSSG：GSH為1：10，pH值為9.5，添加甘氨酸濃度為60 mmol/L，優(yōu)化后的重組人胰島素的復(fù)性率提高到65％。

4、 本實驗還研究了目的蛋白分離純化方法和酶切條件，尋找到合適的分離手段和酶切條件：復(fù)性液過DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換層析柱，pH值6.5，流速0.8ml/min，0.05mol/L可以將雜蛋白洗脫下來，0.1mol/L時洗脫目的蛋白，能夠得到較純的重組人胰島素原。純化后的重組人胰島素原經(jīng)TPCK—胰蛋白酶和羧肽酶B的協(xié)同酶切、Sephadex G-25柱純化后，得到了重組人胰島素。SDS-PAGE電泳分