突變型肝素酶Ⅰ在大腸桿菌Rosetta中的克隆、表達及分離純化.pdf

1、目的：肝素酶是一類能降解肝素類物質的裂解酶，在制備低分子肝素、消除體外循環(huán)中的肝素抗凝劑及確定肝素精確結構等方面有著重要的用途。肝素酶Ⅰ最初是從肝素黃桿菌中被發(fā)現和分離的，因為其可以特異地裂解肝素而在醫(yī)藥工業(yè)方面有著較高的應用價值。但是，肝素酶Ⅰ穩(wěn)定性差，不易提純，造成其產量低、價格昂貴，限制了其在醫(yī)藥工業(yè)領域的廣泛應用。因此，研究和了解肝素酶Ⅰ的結構、性質，通過合適的方法提高肝素酶Ⅰ的純度和產量對于拓寬肝素酶Ⅰ的應用領域有著重要的意義

2、。本研究從一株肝素酶Ⅰ基因發(fā)生突變的肝素黃桿菌入手，通過序列測定確定肝素酶Ⅰ基因中發(fā)生突變的位置，進一步了解突變產生的氨基酸序列對肝素酶Ⅰ活性的影響，同時利用分子生物學手段，在大腸桿菌中對該基因進行克隆和表達，以期獲得獲得產量及活性均較好的重組肝素酶Ⅰ。 方法：通過PCR方法從肝素黃桿菌NBRC12017中擴增得到肝素酶Ⅰ基因，將其克隆至載體pGEM—T Easy上進行測序，通過測序鑒定肝素酶Ⅰ基因中發(fā)生堿基突變的具體位置，進

3、一步測定突變肝素酶Ⅰ的活性，判斷突變氨基酸殘基對肝素酶Ⅰ活性的影響；其次，將克隆得到的突變型肝素酶Ⅰ基因與載體pET28a及pET22b連接，構建獲得三種重組表達載體pET28a/H1、pET28a/H2及pET22b/H1，將上述重組質粒轉入宿主大腸桿菌Rosetta中，通過SDS—PAGE檢測三種工程菌株表達肝素酶Ⅰ的情況，選擇最佳表達菌株和最佳表達條件進行肝素酶Ⅰ的發(fā)酵生產；最后，將發(fā)酵得到的大腸桿菌破壁獲得肝素酶Ⅰ包涵體蛋白，對

4、包涵體蛋白進行洗滌，用8mol/L的尿素使包涵體溶解變性，再使用變性劑濃度/pH雙梯度法通過陽離子交換樹脂柱進行柱上復性及分離純化，對獲得的高純度蛋白進行活性測定。 結果與結論：①從一株肝素黃桿菌中得到了含有堿基突變的肝素酶Ⅰ，通過序列測定及活性研究表明，該肝素酶Ⅰ含有7個堿基的突變，涉及到4個氨基酸殘基的變化，但酶的活性并未受到突變的影響，因此排除了上述突變氨基酸殘基對肝素酶Ⅰ活性的關鍵作用，為尋找影響肝素酶Ⅰ活性的關鍵氨基

5、酸殘基提供了幫助。②構建了3種大腸桿菌表達質粒pET22b/H1、pET28a/H1及pET28a/H2，并將其轉化到了大腸桿菌Rosetta菌中，成功實現了肝素酶Ⅰ的表達，篩選得到的高表達轉化子每升發(fā)酵液中能夠得到約128mg的肝素酶Ⅰ蛋白，較使用普通大腸桿菌得到的67mg/L的包涵體蛋白，本研究將產量提高了兩倍。該系統(tǒng)中，目的基因為前述突變性肝素酶Ⅰ基因，宿主菌為能夠成功表達含有稀有密碼子外源蛋白的大腸桿菌Rosetta。③建立了肝