L-賴氨酸-ε-氧化酶在大腸桿菌中的表達、純化及初步的功能研究.pdf

1、L-氨基酸氧化酶(LAOs,EC1.4.3.2)大部分是黃素蛋白,它們能特異性的催化L-氨基酸的氧化脫氨基作用,伴隨著氧氣的消耗,產(chǎn)生相對應的α-酮酸、過氧化氫和氨氣。但是大部分的氨基酸氧化酶對必需氨基酸的親和性很低。賴氨酸又稱為第一限制性氨基酸。它不僅能調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡,而且對提高體內(nèi)對谷類蛋白質(zhì)的吸收,改善人類膳食營養(yǎng),促進生長發(fā)育都有著重要作用。
　　L-賴氨酸氧化酶能夠與L-賴氨酸發(fā)生特異的催化反應。L-賴氨酸氧化酶有分為

2、L-賴氨酸-α-氧化酶和L-賴氨酸-ε-氧化酶(Lod A)兩種。L-賴氨酸-ε-氧化酶是一種新型的賴氨酸氧化酶。它是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一種非黃素依賴的氨基酸氧化酶,而是依賴其基因下游編碼的一種蛋白分子(Lod B)的作用使其具有活性。但是Lod B的如何發(fā)生作用還不清楚。
　　L-賴氨酸-ε-氧化酶對L-賴氨酸的底物特異性比L-賴氨酸-α-氧化酶更強,它能夠針對賴氨酸的ε位點進行氧化,形成6-半醛-2-氨基己二酸、氨氣和過氧化氫。L

3、od A蛋白有726個氨基酸,晶體結(jié)構(gòu)中只能看到686個氨基酸,在氨基酸序列的C端有41個氨基酸丟失。晶體結(jié)構(gòu)顯示存在包含核心作用位點在內(nèi)的結(jié)構(gòu)域主要是由3組β折疊、一些α螺旋和一些不規(guī)則二級結(jié)構(gòu)形成的桶裝結(jié)構(gòu)組成。Lod A的Trp581和Cys516形成的共價鍵以類似血蛋白醌胺脫氫酶(QHNDH)類似的形式形成硫醚鍵而形成半胱氨酸色氨醌(CTQ)。
　　L-賴氨酸-ε-氧化酶(Lod A)基因的下游存在一個Lod B基因,它們

4、共同構(gòu)成一個操縱子。當Lod B與Lod A不在同一轉(zhuǎn)錄單元時,也能使Lod A蛋白產(chǎn)生活性。當缺乏Lod B時,Lod A沒有L-賴氨酸氧化酶活性。
　　本實驗研究主要在大腸桿菌中成功的表達了Lod A及Lod B蛋白,并將Lod A/B成功共表達。并對Lod A和Lod B蛋白進行了純化。將得到的Lod A、Lod B及Lod A/B進行了SDS-PAGE和凝膠過濾層析,結(jié)果顯示,Lod A、Lod B單表達時均是以大的聚合物

5、的形式存在。共表達的Lod A大部分以二聚體形式存在溶液中。
　　對純化后的Lod A、Lod B及Lod A/B進行酶的活性檢測,單表達蛋白不具備L-賴氨酸氧化酶活性;共表達的Lod A/B蛋白在經(jīng)過陰離子交換層析之后的活性顯著提高。推測其可能與活性蛋白正確折疊而能與陰離子凝膠柱吸附有關(guān)。本研究還對L-賴氨酸氧化酶的活性重建進行初步的研究,結(jié)果表明,Lod B無法在胞外將表達后的Lod A正確折疊或者活性提高。
　　本實驗