重組人干擾素αX在大腸桿菌中的表達(dá)及純化.pdf

1、干擾素(Interferons IENs)是一大類具有抗增生、免疫調(diào)節(jié)和抗病毒活性的細(xì)胞因子，被分為兩個(gè)亞型，干擾素γ是唯一的Ⅱ型干擾素，Ⅰ型目前包括五個(gè)亞型IFN-α、IFN-β、IFN-ω和IFN<,-ι>。擾素臨床適應(yīng)癥較多，其中主要適應(yīng)癥是用于病毒性感染的治療，其次用于腫瘤治療。干擾素可應(yīng)用于許多腫瘤的治療，其中在毛細(xì)胞白血病、AIDS相關(guān)性卡波氏肉瘤、慢性粒細(xì)胞白血病和腎癌等治療中，可以作為主要治療藥物或主要輔助治療藥物。

2、 Ⅰ型IFN具有顯著的抗病毒和抗增殖活性，可由病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生，且各亞型之間具有高度的氨基酸序列相似性。IFN-α是多基因產(chǎn)物，包括23種或更多的亞型，由B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生。IFN-αX是α干擾素的一個(gè)亞型，成熟肽由166個(gè)氨基酸組成，無(wú)糖基化位點(diǎn)，有資料表明IFN-αX的抗增殖活性較IFN-α1的高30倍。對(duì)于IFN-αX純品的獲得，即往的研究者多選擇用病毒或誘生劑誘導(dǎo)人體細(xì)胞產(chǎn)生自然干擾素，然后再提純，存在的問(wèn)題是為多種

3、亞型干擾素的混合體，即使經(jīng)過(guò)提純，最后仍無(wú)法得到某一特定干擾素的單體?；蚬こ谈蓴_素則使之純度提高、副反應(yīng)降低。很多亞型的干擾素都已經(jīng)通過(guò)基因工程的方法獲得其單體，部分已在臨床上得到廣泛應(yīng)用，且療效顯著。但是在我們所復(fù)習(xí)的文獻(xiàn)中，國(guó)外Meister等在大腸桿菌中曾經(jīng)克隆表達(dá)IFN-α X，國(guó)內(nèi)張平武等1995年報(bào)道在大腸桿菌中表達(dá)IFN－α X成功，但是表達(dá)量不高，表達(dá)的目的蛋白以包涵體形式存在，純化與復(fù)性較難，其比活性沒(méi)有我們實(shí)驗(yàn)中的

4、高，且沒(méi)有后續(xù)的批量生產(chǎn)報(bào)道。 本研究根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，優(yōu)化設(shè)計(jì)并分段合成了編碼人干擾素αX序列的正反兩條堿基鏈的全部序列片段，應(yīng)用PCR技術(shù)拼接得到了完整的IFNα XcDNA編碼基因，將其連接于高效原核表達(dá)載體pET32a(＋)上，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coli BL21(DE<,3>)，從而成功得到融合表達(dá)的IFNαX的前體蛋白。通過(guò)表達(dá)條件的進(jìn)一步探索和優(yōu)化，本工程菌的目的蛋白表達(dá)率較高，且大部分呈可溶性表達(dá)，目的蛋白在破菌后

5、上清液中占總蛋白比可達(dá)到52％。由于融合蛋白帶有6×His標(biāo)簽，我們采用Ni<'2+>螯合柱親和層析一腸激酶酶切-Ni<'2+>螯合柱親和層析一離子交換層析純化步驟;最終可得到純度為95.8％的目的蛋白。該蛋白經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)，具有較好的生物學(xué)活性，其比活性為2.52×10<'8>IU/mg，是目前α型干擾素中報(bào)道活性最高的。 總之，在本次實(shí)驗(yàn)中，我們所建立的工程菌其表達(dá)效率高，遺傳穩(wěn)定性也比較好，蛋白純化工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，目的蛋白回