重組人骨形成蛋白-2在大腸桿菌中的高效表達及體外復(fù)性.pdf

1、　　骨形成蛋白—2(Bone Morphogenetic Protein-2,BMP-2)是骨形成蛋白家族成員之一,具有多種生物學(xué)功能,在體內(nèi)不僅可以誘導(dǎo)骨的形成,而且還是胚胎發(fā)育階段必需的細胞調(diào)節(jié)因子,因此在臨床應(yīng)用具有廣闊的前景。
　　本實驗采用分子克隆技術(shù),PCR擴增技術(shù)和DNA點突變技術(shù),將人骨形成蛋白—2基因構(gòu)建到pET35b(+)質(zhì)粒上,轉(zhuǎn)化到BL21(DE3),構(gòu)建的大腸桿菌菌株JH通過IPTG誘導(dǎo)表達重組人骨形成蛋

2、白—2。對重組大腸桿菌JH菌株培養(yǎng)特性和表達研究后,確定了表達菌株JH最佳表達人骨形成蛋白—2條件。IPTG誘導(dǎo)表達重組人骨形成蛋白—2以包涵體的形式存在。本實驗通過DEAE離子交換層析得到高純度的包涵體后,對包涵體變性溶解在氧化—還原(還原型和氧化型谷胱甘肽)復(fù)性系統(tǒng)中,簡單的稀釋方法復(fù)性得到二聚體。最后經(jīng)過肝素親和層析一步純化法,得到高純度的重組人骨形成蛋白—2二聚體和單體。在活性檢測實驗中重組人骨形成蛋白—2二聚體形式明顯地誘導(dǎo)C

3、2C12細胞產(chǎn)生堿性磷酸酶,表明了重組人骨形成蛋白—2具有很高的活性。由于rhBMP-2屬于TGF-β超家族,在序列上它們有高度同源性,具有高度保守Cys-knot結(jié)構(gòu),所以rhBMP-2包涵體成功復(fù)性的方法,可能適合于TGF-β超家族的其他成員。同時,本實驗設(shè)計的復(fù)性工藝簡單易行,從而得到了大量的有活性的rhBMP-2,因此該工藝也為實現(xiàn)重組hBMP-2的大規(guī)模生產(chǎn)創(chuàng)造了條件,對hBMP-2生物特性的研究和臨床上的推廣應(yīng)用也具有重要的