重組人骨形成蛋白復性探討及重組人骨形成蛋白4二連體對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的作用.pdf

1、本文進行了三個部分的研究：進一步探討了骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)的復性方法；構建人骨形成蛋白4成熟肽二連體，并初步探討輻射損傷造血后，它在造血系統(tǒng)修復中所起的作用。 第一部分：重組人骨形成蛋白(rhBMP)復性與活性的探討。目前基因工程制備BMPs的表達系統(tǒng)分為原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)。哺乳動物細胞表達的BMPs具有良好的生物活性，但表達量低，表達產物回收、純化困難、生產成本很高

2、，這就使得BMPs的價格非常昂貴，難以在臨床廣泛使用。原核表達系統(tǒng)，特別是大腸桿菌系統(tǒng)，是經典的表達系統(tǒng)，與真核表達系統(tǒng)相比，它具有表達效率高，容易操作，容易監(jiān)控，產物穩(wěn)定，生產成本低等優(yōu)點。但原核表達系統(tǒng)所表達的蛋白質需要經過正確復性后才能具有生物活性。 探討了rhBMP2m的復性方法，采用了三種不同方案，并通過整體實驗檢查了復性蛋白的誘骨活性。 (1)pH4.8復性液中透析復性，復性后得到的rhBMP2m蛋白可溶性好

3、，通過除菌微孔濾膜基本沒有吸附損失。所得復性蛋白液濃度較高(4.8mg/mL)，通常不必再濃縮就可以使用。直接將復性所得可溶性蛋白液注射入小鼠肌袋，不能誘導骨質生成。蛋白液凍干后，溶解較慢。不加任何載體吸附，1mgrhBMP2m植入小鼠肌袋，三周誘導生成軟骨，四周成骨。表明其具有誘導異位成骨的活性，但誘骨活性不強。 (2)pH6.5復性液中透析復性，復性后蛋白不可溶。不加任何載體吸附，1mgrhBMP2m植入小鼠肌袋，兩周誘導生

4、成骨小梁，并有骨髓樣細胞出現。表明其誘骨活性很強。 (3)pH9.0復性液中稀釋復性，復性后蛋白可溶。蛋白液濃度低(＜200μg/ml)，需濃縮處理，但超濾濃縮時蛋白損失嚴重，反映了所復性的rhBMP2m疏水性強、溶解度低的特點。蛋白液凍干后，成不溶性。不加任何載體吸附，1mgrhBMP2m植入小鼠肌袋，兩周誘導軟骨生成，三周出現骨小梁。表明其誘骨活性一般。 上述3種復性方法差別很大，所得到的復性產物性質和活性也很不相同

5、，但可以看到：復性后的不溶性rhBMP2m有強的誘導異位成骨活性，而可溶性rhBMP2m都沒有誘導異位成骨的活性。因而用于誘導成骨時，應該使rhBMP2m成為不溶狀態(tài)；而以往的實驗表明，當要發(fā)揮其誘導造血活性時，應當使用其可溶形式。 第二部分：重組人骨形成蛋白4成熟肽二連體(rdhBMP-4m)的設計和制備。 對BMP4成熟肽基因的原核表達及復性的研究已有報道，同BMP2一樣，大腸桿菌表達的rhBMP4m單體，需經體外復

6、性，以獲得rhBMP4m二聚體。二聚體是BMP的活性形式，其單體內含有3對二硫鍵，而兩個單體間由一對二硫鍵連接，BMP的復性包括這7對二硫鍵形成及BMP分子的正確折疊。其中形成分子間二硫鍵的半胱氨酸位于單體分子的末端，形成二硫鍵使兩個單體首尾相連，形成二聚體。其中分子間二硫鍵的形成尤為重要，是BMP復性的關鍵所在，這就使得其復性過程變得更加復雜和困難。 針對這一特點，設計用基因工程手段使大腸桿菌直接表達有類似二聚體結構，稱之為基

7、因重組骨形成蛋白4二連體(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein-4maturepeptideduplex，rdhBMP-4m)。構建方案是：利用PCR定點突變方法對編碼rhBMP-4m肽鏈的cDNA進行定點突變，突變掉形成單體間二硫鍵的半胱氨酸，使2個rhBMP-4m間不以雙硫鍵(-S-S-)，而是通過增加一段連接肽以肽鍵(-CO-NH-)將兩個單體直接首尾相連接，原核細胞表達后直接生成類似二

8、聚體的結構。連接肽大部分是由甘氨酸和絲氨酸組成，因為甘氨酸所組成的肽鍵有對稱性的碳原子，可以任意轉動，有利于蛋白分子的復性，但甘氨酸集團為疏水性，可以埋入蛋白質分子中，使其結構受到影響，絲氨酸帶羥基為親水性氨基酸，與甘氨酸搭配可以增加連接肽的親水性從而使連接肽獨立于蛋白分子之外，不會影響蛋白的三維結構。 成功構建pDH2-rdhBMP-4m表達載體，DNA序列實際測定結果與預期設計的完全一致。將pDH2-rdhBMP-4m轉入E

9、.coliDH5α，成功構建得穩(wěn)定傳代和表達的pDH2-rdhBMP-4m/DH5α工程菌株。 將rdhBMP-4m/DH5α工程菌株進行高密度發(fā)酵、溫度誘導表達，測定發(fā)酵菌液OD600值為49.0，表達產物以包涵體形式存在，目的蛋白占細菌總蛋白量的29％；離心收集菌體，經裂菌、超聲洗滌四次后，包涵體中目的蛋白的純度為65％；離子交換柱層析后得到純度為96％的rdhBMP-4m。采用與rhBMP2m相同的復性方法，得到可溶性的r

10、dhBMP-4m。 第三部分：重組人骨形成蛋白4成熟肽二連體對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)修復的作用。 造血器官是輻射敏感組織，電離輻射主要損傷有增殖能力的造血干細胞、祖細胞和幼稚血細胞，使造血細胞直接致死或誘導凋亡，從而導致造血細胞的增殖和更生障礙。CD34是造血細胞的表面標志，CD34+的百分比能夠反映骨髓造血系統(tǒng)的狀況。多種造血因子能增加CD34+細胞的數量，提高骨髓的造血功能。我們以前的研究已經報道致死劑量照射的小鼠，用

11、可溶性rhBMP-2m治療，能促進造血細胞的增殖和造血系統(tǒng)的恢復，顯著提高極重度急性造血型放射病小鼠的存活率。BMP4作為造血因子，對胚胎造血系統(tǒng)的發(fā)育有重要作用，能夠促進干細胞的增殖分化，使骨髓保持旺盛的增殖能力。但BMP4對損傷的造血系統(tǒng)是否有修復作用，目前尚無報道。由本研究組首次構建具有與rhBMP4m二聚體類似的結構的rdhBMP-4m，是否具有活性，也必需通過實驗觀察。 實驗觀察了rdhBMP-4m對輻射致骨髓損傷小鼠

12、造血系統(tǒng)功能修復的作用。7.0Gy60Coγ射線照射，造成小鼠急性重度造血型放射病。(1)從d1起，治療組腹腔注射rdhBMP-4m(0.5mg/1.0ml/只)，照射對照組注射生理鹽水(1.0ml/只)，連續(xù)注射6天。分別于第1、3、5、7、9天檢測外周血白細胞數、骨髓單個核細胞數、CD34+細胞百分率；第9天進行CFU-S計數；連續(xù)飼養(yǎng)30天觀察小鼠存活率。正常小鼠白細胞數為(7.30±0.23×109*L-1)，60Coγ照射后迅

13、速減少，第5天降到最低點，對照組為(1.18±0.23×109*L-1)，治療組為(1.27±0.22×109*L-1)，均明顯低于正常水平。治療后，從第7天開始，外周血白細胞數逐漸增加，并顯著高于對照組。第7天，治療組為(2.41±0.24×109*L-1)，相比對照組(1.35±0.29×109*L-1)，差異有顯著性(P＜0.05，n=6)；第9天，治療組為(3.8±0.23×109*L-1)，相比對照組(1.93±0.20×10

14、9*L-1)，差異有顯著性(P＜0.05，n=6)。(2)正常小鼠單個核細胞數為(14.58±1.32×106*L-1)，60Coγ照射后迅速減少，第1天為(2.51±0.60×106*L-1)，明顯低于正常水平。治療后，單個核細胞逐漸增加，從第7天開始顯著高于對照組。第7天治療組為(5.31±0.34×106*L-1)，相比對照組(4.01±0.24×106*L-1)，差異有顯著性(P＜0.05，n=6)；第9天治療組為(6.74±0

15、.36×106*L-1)，相比對照組(4.42±0.26×106*L-1)，差異有顯著性(P＜0.05，n=6)。(3)正常小鼠骨髓單個核細胞中CD34+細胞百分率為(7.12±0.25％)，60Coγ照射后迅速降低，第1天為(1.31±0.22％)，明顯低于正常水平。治療后，CD34+細胞百分率逐漸增加，從第7天開始顯著高于對照組。第7天，治療組為(3.21±0.23％)，相比對照組(2.30±0.21％)，差異有顯著性(P＜0.05

16、，n=6)；d9，治療組為(3.97±0.31％)，相比對照組(2.53±0.28％)，差異有顯著性(P＜0.05，n=6)。(4)第9天處死小鼠，將脾臟固定染色并記數，治療組CFU-S數為(40.5±3.8)，相比照射對照組(14.17±1.8)，差異有顯著性(P＜0.01，n=6)。(5)照射后30天治療組存活率為(40％)，對照組為(15％)，差異有顯著性(P＜0.05，n=20)。60Coγ射線照射后，經rdhBMP4m治療，促