重組人成骨蛋白-1在大腸桿菌中的高效表達(dá)及復(fù)性.pdf

1、近年來，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bonemophorgeneticprotein，BMP)作為一種有價(jià)值的生長因子越來越受到人們的重視。OP-1又名BMP-7，便是其中備受關(guān)注的成員。OP-1是一種骨誘導(dǎo)形成素，在胚胎的骨骼發(fā)育和骨修復(fù)中發(fā)揮作用。體外研究表明，rhOP-1可刺激間充質(zhì)細(xì)胞的增殖及其向成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的分化，并促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶的分泌。由于OP-1具有強(qiáng)烈的骨誘導(dǎo)活性，臨床已將其用于治療骨折、骨不愈合，促進(jìn)脊椎愈合

2、等，取得顯著療效。此外，OP-1在胚胎時(shí)期廣泛表達(dá)，在成年時(shí)主要表達(dá)在腎臟，對腎臟發(fā)育中具有誘導(dǎo)組織相互作用的潛在功能，是重要的腎臟形態(tài)發(fā)生蛋白和腎臟內(nèi)分泌激素。OP-1對動(dòng)物模型中多種急性腎病具有防御作用，可以改善腎小球和腎間質(zhì)纖維化，對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎臟的結(jié)構(gòu)和功能具有維持和恢復(fù)作用。OP-1對腎病的治療已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)。 隨著OP-1在臨床研究工作的展開，人們需要大量高純度、有活性的rhOP-1用于疾病治療。從骨基質(zhì)

3、中提取的OP-1活性高，但步驟繁瑣，產(chǎn)量較低。目前為止已有多種重組BMP蛋白被成功表達(dá)。國內(nèi)也有人利用大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞和CHO細(xì)胞表達(dá)rhOP-1。但是利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的rhOP-1，蛋白質(zhì)濃度較低，不利于后續(xù)的純化等工作。大腸桿菌可以高效表達(dá)rhOP-1，但由于rhOP-1以包涵體的形式表達(dá)，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性，也是該實(shí)驗(yàn)要解決的問題。 研究目的： 該實(shí)驗(yàn)室已對rhOP-1進(jìn)行了長期細(xì)致深入的研究，獲得了大量的

4、經(jīng)驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，該項(xiàng)工作旨在實(shí)現(xiàn)rhOP-1成熟肽在大腸桿菌BL21中的高效表達(dá)，并進(jìn)一步摸索rhOP-1包涵體復(fù)性的影響因素，確定復(fù)性條件，初步探索將層析法用于rhOP-1的復(fù)性中，以獲得大量有生物活性的rhOP-1，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pBV221轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coliBL21,30℃發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量使培養(yǎng)基的溶氧保持在20％以上，利用2mo

5、l/LNaOH和1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH值。以葡萄糖為碳源，酵母提取物+蛋白胨作為氮源，補(bǔ)充養(yǎng)料。迅速升溫至42℃誘導(dǎo)rhOP-1高效表達(dá)，rhOP-1以包涵體的形式存在。利用超聲裂解法破裂細(xì)菌，經(jīng)多次洗滌后收集包涵體，用含有6mol/L尿素+30mmol/LDTT的包涵體溶解液溶解目的蛋白。經(jīng)WesternBlot鑒定是目的蛋白rhOP-1后，利用強(qiáng)陽離子交換介質(zhì)SPSepharose-FastFolw一步純化rhOP-1。通過改變

6、pH值、復(fù)性時(shí)間以及添加多種小分子化合物對rhOP-1復(fù)性。初步將陽離子、陰離子交換層析法及尺寸排阻層析法(SEC)用于rhOP-1的復(fù)性。以MTT和PNPP法體外測定復(fù)性后的rhOP-1促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和堿性磷酸酶(ALP)的分泌的生物活性。 研究結(jié)果： (1)發(fā)酵培養(yǎng)工程菌大腸桿菌BL21時(shí)，升溫誘導(dǎo)4hr時(shí)rhOP-1的表達(dá)量最高，占菌體蛋白的33％。放罐時(shí)OD600nm值可達(dá)9.2，15g菌體/L培養(yǎng)液。We

7、sternBlot鑒定表明，菌體在分子量約為15kD和30kD處各有一條特異性條帶，證明所表達(dá)的外源蛋白就是目的蛋白rhOP-1。純化后蛋白溶液的SDS-PAGE電泳圖譜經(jīng)Totallab分析，rhOP-1的純度可達(dá)98％以上。 (2)透析復(fù)性的pH值為6.0，此時(shí)可以獲得更好的復(fù)性效果。復(fù)性時(shí)透析的時(shí)間不宜過長，每隔8hr即可更換透析液降低尿素濃度。L－精氨酸可以有效的抑制復(fù)性過程的沉淀的產(chǎn)生，而半胱氨酸/胱氨酸最利于rhOP

8、-1鏈間二硫鍵的生成，可使rhOP-1的活性成分二聚體的含量達(dá)到31％。其次為GSH/GSSG，rhOP-1二聚體為27％。 (3)層析復(fù)性時(shí)，蛋白溶液流經(jīng)層析介質(zhì)SP-FF和DEAE-FF時(shí)，降低尿素濃度均使得rhOP-1沉淀在介質(zhì)上，且無法用2mol/LNaCl溶液洗脫。對于SEC來說，同樣存在沉淀問題，且復(fù)性后的單體、二聚體無法分離，具體條件仍需進(jìn)一步摸索。 結(jié)論： 建立了高效表達(dá)rhOP-1的工程菌的發(fā)酵