重組人干擾素a-2b在大腸桿菌中分泌表達(dá).pdf

1、目的：依據(jù)基因BANK中基因序列設(shè)計相應(yīng)引物克隆出人干擾素α-2b基因序列，構(gòu)建多種重組人干擾素α-2b的原核分泌型表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21和大腸桿菌W3110的感受態(tài)細(xì)胞中。分析不同宿主細(xì)菌對目標(biāo)蛋白的表達(dá)量和分泌效率的影響，經(jīng)SDS-PAGE,Westernblot等手段鑒定獲得較為理想重組人干擾素α-2b的原核分泌型工程菌株pPSIFN-4L/E.co/iW3110。方法：根據(jù)大腸桿菌編碼基因密碼子的偏愛性原則，在不改變h

2、uIFN-α2b原有氨基酸序列的前提下，定向突變huIFN-α2b編碼基因5’端得序列并且PCR擴(kuò)增出huIFN-α2b＇基因，克隆至pGEM7zf(-)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)-白斑篩選及測序驗證正確；設(shè)計引物從大腸桿菌基因組中克隆出STⅡ信號肽基因序列，用同樣方法驗證正確。利用重疊PCR技術(shù)實現(xiàn)STⅡ信號肽基因和huIFN-α2b＇基因的融合，再分別引入酶切位點BamHI/SalI,NdeI/HindⅢ以及NsiI/

3、XhoI將融合基因片段STⅡ-huIFN-α2b＇克隆至載體pCSE、pET-22b和pPAK4L中，構(gòu)建分泌型表達(dá)載體pCSIFN、pESIFN-22b和pPSIFN-4L。pCSIFN轉(zhuǎn)入大腸桿菌W3110，pESIFN-22b轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，pPSIFN-4L分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21和大腸桿菌W3110。誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)蛋白，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE，使用WesternBlot免疫印跡法分析驗證并用WISH-VSV系統(tǒng)細(xì)胞

4、病變抑制法(CPE)來測定表達(dá)的目標(biāo)蛋白抗病毒活性及其效價。結(jié)果：融合基因在載體pCSE中表達(dá)量很低，其中約有50％的目標(biāo)蛋白能夠成功實現(xiàn)分泌。在E.coliBL21中，pET-22b經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)可以實現(xiàn)huIFNα-2b的高表達(dá)，但在分泌過程中STⅡ信號肽不能被有效切除。含有phoA啟動子的載體pPAK4L其在E.coliW3110中可以實現(xiàn)huIFNα-2b較高水平的分泌表達(dá)，經(jīng)過低磷誘導(dǎo)其表達(dá)量最高可至20μg/ml(A550

5、)菌液，約有30％的目標(biāo)蛋白質(zhì)信號肽能夠被成功切除并分泌到胞間質(zhì)中。Westernblot表明目標(biāo)蛋白具有與huIFN-α2b標(biāo)準(zhǔn)品相同的免疫原性；離心收集菌體，加入一定量的PBS(pH8.0)反復(fù)凍融后取上清液，WISH-VSV系統(tǒng)證實其總活性達(dá)1.425×l05IU/ml，相對的包涵體表達(dá)體系作為對照其總活性為1.259×103IU/ml。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建5’端突變的huIFN-α2b原核分泌型表達(dá)工程菌pPSIFN-