轉(zhuǎn)氨酶ATA117在大腸桿菌中的高效重組表達(dá)及催化制備西他列汀.pdf

1、轉(zhuǎn)氨酶ATA117在合成手性胺類藥物西他列汀中具有重要用途，本論文構(gòu)建了不同的表達(dá)體系，優(yōu)化表達(dá)條件，以實(shí)現(xiàn)ATAT117的高效表達(dá)，并對(duì)重組轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵工藝和產(chǎn)品西他列汀的制備工藝進(jìn)行研究。
　　我們首先以E.coliBL21(DE3)作為宿主，構(gòu)建了PBV220-ATA117，pCDFDuet-ATA117，pETDuet-ATA117和pRSFDuet-ATA117四種重組載體，從蛋白表達(dá)水平和催化活力上進(jìn)行了考察，選出表達(dá)

2、能力較高的載體pETDuet-ATA117，其活力為137U/L，比活為0.24U/mg粗蛋白。
　　對(duì)重組轉(zhuǎn)氨酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征，其最適pH為9.0，在pH7.0-10.0的范圍內(nèi)都表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性，該酶同時(shí)也具有很好的熱穩(wěn)定性，在反應(yīng)溫度45℃時(shí)，酶活力半衰期達(dá)到47.8h，在常溫下，半衰期超過(guò)100h。
　　為了提高Eco(pETDuet-ATA117)的發(fā)酵酶活，我們先使用單因素法和響應(yīng)面法結(jié)合的方式對(duì)培養(yǎng)基成

3、分進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基配方:甘油14.45g/L，酵母粉7.27g/L，胰蛋白胨5.72g/L，NaCl10g/L，K2HPO44g/L。在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上又對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行了研究，最適誘導(dǎo)條件下酶活為713.7U/L。隨后進(jìn)行了10L發(fā)酵罐中的分批和補(bǔ)料發(fā)酵工藝研究，最終菌體密度達(dá)到29.78g/L，酶活力達(dá)到3971U/L，比LB培養(yǎng)基發(fā)酵提高了30多倍。
　　通過(guò)制備工藝的優(yōu)化，50g/L底物濃度時(shí)，最佳的助溶劑為40