鮭魚降鈣素及其變異體在大腸桿菌中的高效表達及重組多肽的性質研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學博士學位論文鮭魚降鈣素及其變異體在大腸桿菌中的高效表達及重組多肽的性質研究姓名：劉深基申請學位級別：博士專業(yè)：生化及分子生物學指導教師：陳松森19991001中田協(xié)和醫(yī)科大學博士學位論文： 摘要f ∞了便于裂解后小肽的分離純化，我們用定點突變的方法將T r x ．s C T ．G 1 y 基因第3 8 位M e t 突變?yōu)锳 l a ，并將突變后的基因克隆于p E T 3 0 a 載體的N d e I 和H i n dI

2、 I I 切點之間，轉入表達菌體B L 2 1 中，在I P T G 的誘導下，融合蛋白T r x ．s C T ．G l y的表達水平可達到5 6 ％。在研究表達條件時，我們發(fā)現(xiàn)了表達“滲漏現(xiàn)象”，即細菌在未加誘導荊的條件下較長時間培養(yǎng)能夠離水平地表達目的蛋白。在我們的表達體系中，工程菌株在對數(shù)生長階段并沒有或很少表達外源蛋白，只有當培養(yǎng)時間足夠長時，才能積累大量的目的蛋白。2 0 小時培養(yǎng)后，菌體內目的蛋白的表達水平可達到菌體總蛋白

3、的5 1 ％，菌體總量可達到每升培養(yǎng)基收獲8 一l O g 濕菌體，因而這樣的“表達滲漏”現(xiàn)象對于大量制各重組蛋白具有很重要的應用價值。用T h i o B i n d 親和樹脂純化表達的蛋白，結果說明3 8 位的M e t 突變?yōu)锳 l a 不影響融合蛋白與樹脂的特異性結合，純化的目的蛋白純度可達到9 0 ％以上。優(yōu)選C N B r裂解融合蛋白的條件，確定在含有3M 的尿素的7 0 ％的甲酸中，室溫4 8 小時，融合蛋白裂解較好，至少

4、8 0 ％的蛋白被C N B r 裂解開。s C T - G I y 的分離純化是另外一個難點，不僅因為其分子小，而且在許多分離介質上有嚴重的非特異性吸附。在實驗中我們采用了C M 一纖維索作為分離介質，避免了非特異性吸附，而且用O ．1 5 N 鹽酸解吸附可以在冷凍干燥時去掉，避免了脫鹽時的麻煩。該方法可以得到純度為9 2 ％的s C T ．G l y ，且產(chǎn)率也達9 0 ％以上。N 一末端1 0 個氨基酸的序列分析說明，表達、分離的

5、產(chǎn)物與預期一致。在強酸性條件下，沒有發(fā)生氨基酸的脫酰胺反應。氨基酸組成分析與預期基本一致。質譜法測定的分子量為3 4 9 2 道爾頓，毛細管電泳! 測定等電點為6 ．4 6 ，大鼠降血鈣活性為1 9 0 I U ／m g左右，與天然的人降鈣素相當。此研究為用基因工程的方法生產(chǎn)蘑組s C T 打下了良好的基礎，7 ”一三．人源化鮭魚降鈣素的構建與表達·f 鮭魚降鈣素雖然是一種安全有效的骨代謝藥物，但是長期使用會刺激人體產(chǎn)生特異性

6、抗體，其影響可能涉及到副作用的發(fā)生和療效的降低。為了降低其免疫原性，我們設計并構建了人源化鮭魚降鈣素( 1 1 ．1 5 ’) h s C T 。并將該基因克隆于p T r x F u s 表達載體中，在色氨酸的誘導下，獲得高效可溶性表達，表達水平為4 6％以上。用滲透壓法處理，能得到純度較高的融合蛋白。初步活性測定結果表明，( 1 1 —1 7 ) 人源化的鮭魚降鈣素保存了鮭魚降鈣素前體活性的一半以上。定量W e s t e mB l