重組人神經(jīng)生長因子在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及其分離純化研究.pdf

1、人神經(jīng)生長因子（human nerve growth factor，簡稱hNGF）是人體中一種對正常神經(jīng)細(xì)胞有營養(yǎng)作用，對損傷神經(jīng)修復(fù)機(jī)能有調(diào)節(jié)作用的生物活性因子，它可維持交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)的生存，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化，決定軸突的伸展方向。對促進(jìn)大腦的發(fā)育，神經(jīng)系統(tǒng)的生長，損傷神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)具有決定性作用。 hNGF的 β亞基單體有118個氨基酸，有3對活性必需的鏈內(nèi)二硫鍵，這三對二硫鍵使其在作為包涵體表達(dá)時復(fù)性困難，生物活

2、性不穩(wěn)定；用分泌系統(tǒng)表達(dá)時容易造成溶菌、活性和回收率非常低等問題，使其產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程非常緩慢。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為基因工程研究最早開發(fā)的安全、經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)系統(tǒng)，具有其他表達(dá)系統(tǒng)所不具備的明顯優(yōu)勢。但大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)仍然具有不完善的地方，如蛋白表達(dá)時易形成不正確折疊，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)失活，影響生物活性等。為了有效表達(dá)rhNGF，本課題將rhNGF與大腸桿菌硫氧還蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，硫氧還蛋白引導(dǎo)其后的蛋白正確折疊，呈可溶性表達(dá)，具有天然生物

3、學(xué)活性。 課題研究了rhNGF的表達(dá)載體構(gòu)建、在大腸桿菌中的表達(dá)和分離純化及結(jié)構(gòu)和生物活性分析。經(jīng)發(fā)酵工藝研究，融合蛋白表達(dá)量約占總蛋白的17.5％；純化后，蛋白的純度可達(dá)到95％以上，活性為4.0×104 U/ml左右，比活性約為1.2×105 U/mg，活性回收率為26％。樣品經(jīng)過Western blot試驗、質(zhì)譜分析、園二色譜等分析，結(jié)果證明本課題構(gòu)建的工程菌pTHNGF／JM109表達(dá)的rhNGF結(jié)構(gòu)正確。 本課