血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1在大腸桿菌中的表達(dá)與純化.pdf

1、研究背景：1971年，美國(guó)學(xué)者Folkman首先提出“腫瘤生長(zhǎng)依賴血管生成”的著名學(xué)說，并由此提出了抑制腫瘤生長(zhǎng)的新途徑-抗血管生成(antiagiogensis)。隨后許多學(xué)者經(jīng)研究證實(shí)了腫瘤血管生成在實(shí)體瘤生長(zhǎng)、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中的重要作用。大部分腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移均依賴于腫瘤的血管生成，腫瘤的生長(zhǎng)可分為無血管期和血管期，腫瘤直徑達(dá)1～2mm時(shí)，腫瘤分泌若干因子刺激血管形成，獲得供血的腫瘤繼續(xù)增大乃至轉(zhuǎn)移。因此，近年來阻斷腫瘤血管形成

2、成為治療腫瘤的新方法。腫瘤血管形成受許多因素的調(diào)節(jié)，其中，具有重要研究意義的是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial groth factor，VEGF)。它能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，同時(shí)，也能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。VEGF通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體VEGF受體(VEGFR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。 VEGFR-1對(duì)VEGF發(fā)揮雙重效應(yīng)：在生理情況下，主要起負(fù)向調(diào)控VEGF的生物學(xué)作用，而在某些病理情況

3、下VEGFR-1可以發(fā)揮正向調(diào)控VEGF的作用，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管通透性增加方面起了重要作用。因此，VEGF及其受體就成了腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。因此，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)的研究將具有重要意義。 目的：擴(kuò)增目的基因VEGFR-1，構(gòu)建pET-28a(+)/VEGFR-1重組體，在大腸桿菌中高效表達(dá)VEGFR-1蛋白，純化VEGFR-1蛋白。 方法：以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的克隆質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)

4、合適引物，連接PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pET-28a(+)質(zhì)粒，把該質(zhì)粒命名為pET-28a(+)/VEGFR-1，把該質(zhì)粒移進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌株，提取質(zhì)粒，把質(zhì)粒移進(jìn)BL21感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌株，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)VEGFR-1蛋白質(zhì)，超聲破菌，經(jīng)鎳凝膠親和層析純化蛋白。 結(jié)果：成功構(gòu)建pET-28a(+)/VEGFR-1重組體；SDS-PAGE電泳顯示，融合蛋白的表達(dá)量顯著，分子質(zhì)量約17kD。 結(jié)論：在大