血管內(nèi)皮生長因子受體2在毛囊上皮細胞中的表達及功能研究.pdf

1、研究背景:
　　 血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)家族已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的成員包括VEGF-A、VEGF-B、 VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和P1GF(placentagrowth factor，胎盤生長因子)，是目前研究較為深入的血管生長因子家族。其中最主要的成員是VEGF-A，又稱VEGF,1-3在人類，主要包括幾種分子量不同的同種異構體，如:VEGF1

2、21、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206等1，其中VEGF165效應性最強4。
　　 血管內(nèi)皮細胞特異性的VEGF受體(VEGF receptor，VEGFR)介導VEGF家族成員對內(nèi)皮細胞增殖、微血管增生及增強血管通透性等的作用3，5，其可分為兩大類:酪氨酸激酶受體(VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3)，與非酪氨酸激酶受體（neuropilin-1（NRP-1），neuropilin-2

3、(NRP-2)。對內(nèi)皮細胞的增殖、分化作用主要由VEGFR-2介導的6，7。近年來發(fā)現(xiàn)VEGFR-2除了表達在血管內(nèi)皮細胞外，而且還表達在一些非血管內(nèi)皮細胞上，如黑素細胞11、視網(wǎng)膜上皮細胞10、造血干細胞、神經(jīng)元細胞、血管平滑肌細胞9以及某些腫瘤細胞8。而且在正常人的皮膚角質(zhì)形成細胞、毛囊上皮細胞（包括毛囊隆突部細胞）、汗腺及皮脂腺細胞均發(fā)現(xiàn)VEGFR-2的表達。因此證實VEGF-2在毛囊上皮細胞中表達的生物學意義有助于解決毛囊生物學

4、中的一些問題。
　　 目的:
　　 明確VEGFR-2在毛囊上皮細胞中的表達情況，及與毛發(fā)周期的相關性。研究毛乳頭細胞分泌的VEGF除以旁分泌的形式發(fā)揮血管形成作用之外，是否還可以通過VEGFR-2直接作用于毛囊上皮細胞產(chǎn)生生理調(diào)節(jié)作用。重點研究VEGFR-2在毛囊隆突部細胞中的表達、VEGF對其表達的影響以及通過VEGFR-2介導的毛囊隆突部細胞的增殖、遷移和黏附，以及VEGFR-2下游信號表達的影響。
　　

5、方法:
　　 第一部分:用免疫熒光法檢測VEGFR-2在小鼠不同毛發(fā)周期中的表達情況。利用免疫熒光雙染技術，探討了在人頭皮毛囊中VEGFR-2與增殖、分化、凋亡指標的免疫熒光共染情況。
　　 第二部分:用VEGFR-2的中和性抗體MAB3572預處理，同時使用外源性VEGF165作為刺激因子刺激體外培養(yǎng)的人毛囊隆突部細胞，提取總RNA和蛋白質(zhì)，以逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測毛囊隆突部細胞VEGFR-2 mRN

6、A的表達水平;以Western-blot法檢測培養(yǎng)的隆突處細胞VEGFR-2蛋白質(zhì)的表達水平，觀察對角蛋白K10、K14、K16、K19以及β-catenin、integrinβ1、Lgr6、Artemis(Serine516)表達的影響。分別用MTT法、Trans well法觀察不同濃度VEGF165作用下體外培養(yǎng)的經(jīng)MAB3572預處理或未預處理的隆突部細胞增殖、粘附和遷移能力的變化。以25ng/ml VEGF165刺激MAB357

7、2預處理或未預處理的隆突部細胞，以Western-blot法檢測觀察其對VEGFR-2、P38、C-Jun、ERK1/2磷酸化的影響，探討VEGFR-2介導的調(diào)節(jié)細胞活性的細胞內(nèi)信號傳導途徑。
　　 第三部分:提取總RNA，以逆轉錄-聚合酶鏈反應(Reverse transcriptpolymerase chain reaction，RT-PCR)檢測人毛囊Artemis mRNA的表達水平，用免疫熒光法檢測Artemis(Se

8、rine516)在人頭皮毛囊、皮脂腺、汗腺等處的表達，以及在小鼠不同毛發(fā)周期毛囊中的表達情況。利用免疫熒光雙染技術，探討了毛囊隆突部細胞Artemis(serine516)與增殖、分化、凋亡指標的免疫熒光共染情況。
　　 結果:
　　 一、免疫組化發(fā)現(xiàn)人頭皮毛囊表達VEGFR-2及磷酸化VEGFR-2，小鼠毛囊上VEGFR-2表達隨毛發(fā)周期發(fā)生改變。
　　 二、VEGFR-2與K16、K14、p-P53、Bax、

9、 bcl-2、β-catenin、integrinβ1等熒光雙染重疊良好。在髓質(zhì)、皮質(zhì)區(qū)域與K10、involucrin等熒光雙染重疊良好。
　　 三、VEGFR-2培養(yǎng)的隆突部細胞的表達:
　　 1)RT-PCR:體外培養(yǎng)的隆突部細胞表達VEGFR-2 mRNA，VEGF165促進體外培養(yǎng)的隆突部細胞表達VEGFR-2 mRNA，VEGFR-2中和性抗體MAB3572能夠拮抗VEGF165對體外培養(yǎng)的隆突部細胞表達VE

10、GFR-2 mRNA表達的上調(diào)。
　　 2) Western-blot:體外培養(yǎng)的隆突部細胞在蛋白質(zhì)水平表達VEGFR-2。VEGF165促進體外培養(yǎng)的隆突部細胞表達VEGFR-2，VEGFR-2中和性抗體MAB3572能夠拮抗VEGF165對體外培養(yǎng)的隆突部細胞表達VEGFR-2表達的上調(diào)。
　　 四、VEGF165促進體外培養(yǎng)的隆突部細胞的增殖、異質(zhì)性粘附、遷移能力，抑制同質(zhì)性粘附能力。
　　 五、VEGFR

11、-2中和性抗體MAB3572能夠拮抗VEGF165對體外培養(yǎng)的隆突部細胞增殖、異質(zhì)性粘附、遷移能力的促進及同質(zhì)性粘附能力抑制。
　　 六、VEGFR-2中和性抗體MAB3572能夠拮抗VEGF165對體外培養(yǎng)的隆突部細胞促進表達整合素β1及Artemis(Serine516)，抑制表達Lgr6。
　　 七、VEGFR-2中和性抗體MAB3572能夠拮抗VEGF165對體外培養(yǎng)的隆突部細胞表達K16、K19、K14等的促進

12、作用。
　　 八、VEGFR-2中和性抗體MAB3572能夠拮抗VEGF165對體外培養(yǎng)的隆突部細胞表達K10的抑制作用。
　　 九、VEGF165促進體外培養(yǎng)的隆突部細胞VEGFR-2、c-Jun、ERK1/2、p38的磷酸化及β-catenin向細胞核內(nèi)轉位， VEGFR-2中和性抗體MAB3572能夠拮抗VEGF165對隆突部細胞VEGFR-2、c-Jun、ERK1/2、p38的磷酸化作用及β-catenin向細胞

13、核內(nèi)轉位。
　　 十、VEGF165促進體外培養(yǎng)的隆突部細胞Artemis在serine516位點的磷酸化，VEGFR-2中和性抗體MAB3572能夠拮抗VEGF165對隆突部細胞Artemis在serine516位點的磷酸化。
　　 十一、Artemis(serine516)的表達方式隨毛發(fā)周期改變。在人頭皮生長期毛囊中的上半部分上皮細胞與表皮強陽性表達Artemis(serine516)，在汗腺及皮脂腺也可見Arte

14、mis(serine516)表達。
　　 十二、Artemis(serine516)與K16熒光雙染重疊良好，但是與K10、p-P53、Bax、bcl-2、K14、Ki67等信號表達趨勢相反;與c-myc、p21表達位置緊鄰，信號表達趨勢相一致。
　　 結論:
　　 一、毛囊上皮包括隆突部細胞在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均表達VEGFR-2。
　　 二、VEGFR-2參與介導毛囊隆突部細胞的增殖、遷移、粘附、