人血管內(nèi)皮生長因子受體-2基因（KDR）在鏈霉菌和大腸桿菌的克隆表達及其抑制劑篩選模型的構(gòu)建研究.pdf

1、血管生成是毛細血管從已構(gòu)建的毛細血管網(wǎng)中以出芽方式新生的過程，參與許多病理和生理過程如傷口愈合、組織再生、子宮內(nèi)膜周期性增生以及腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管生成。尤其在實體瘤的惡性生長和轉(zhuǎn)移中，腫瘤的血管生成起到重要的作用。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)作為血管內(nèi)皮細胞特異的有絲分裂原，直接參與了血管形成這個過程，促進內(nèi)皮細胞分裂增殖，促使新生血管形成，同時還可有效地提高血管的通透

2、性。VEGF這一功能是通過和其特異性受體結(jié)合來發(fā)揮作用的。vEGF受體家族主要包括三個成員：VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、VEGFR-3(Flt-4)，它們都屬于受體酪氨酸激酶(RTK)Ⅲ型超家族。研究表明VEGFR-2(KDR/Flk-1)在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖、分化反應(yīng)中最為重要，是內(nèi)皮細胞VEGF信號傳導(dǎo)的主要執(zhí)行者，VEGF與KDR結(jié)合使受體二聚體化，進一步激發(fā)KDR酪氨酸發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致自身酶

3、活性和下游信號相關(guān)酶類的激活，從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞相關(guān)反應(yīng)。新生血管的形成對惡性腫瘤的生長是必不可少的因素，因而以KDR為靶點進行藥物設(shè)計和篩選可成為抗腫瘤血管生成的重要方略。 KDR基因全長5821bp，編碼基因位于4q12，編碼區(qū)為4068bp，編碼1356個氨基酸。由胞外7個Ig樣結(jié)構(gòu)域，一個跨膜域和胞內(nèi)域組成。胞外域由766個氨基酸組成，第2-3 Ig樣結(jié)構(gòu)域是主要VEGF結(jié)合區(qū)。KDR胞內(nèi)區(qū)有565個氨基酸組成，可分為

4、激酶功能區(qū)、68個氨基酸的酪氨酸激酶插入?yún)^(qū)和羧基末端。 本研究從人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HuvEC)中提取總RNA，以其為模板，通過RT-PCR擴增獲得編碼KDR編碼胞外區(qū)1-3 Ig樣結(jié)構(gòu)域(KDR-ED)和胞內(nèi)酪氨酸激酶催化區(qū)域(KDR-CD)的基因片段。測序結(jié)果同已知KDR基因編碼序列進行比較，結(jié)果一致。 以鏈霉菌為表達體系進行基因表達。利用本實驗室自行構(gòu)建的新型鏈霉菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pSGLgpp作為KDR-ED和K

5、DR-CD的基因表達載體。將KDR-ED和KDR-CD編碼基因分別克隆至載體的gPP信號肽編碼序列下游。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至S.lividans TK24 原生質(zhì)體，經(jīng)再生得到轉(zhuǎn)化子，重組菌分別命名為S.lividans[pSGLgpp/KDR-ED]和S.lividans[pSGLgpp/KDR-CD]。SDS-PAGE結(jié)果表明，S.lividans[pSGLgpp/KDR-CD]分泌表達44kD的特異蛋白條帶。采用磷酸化的酪氨酸抗體在沒有

6、加入ATP的情況下對KDR-CD蛋白進行western blot檢測，結(jié)果出現(xiàn)44kD的單一雜交帶，表達的KDR-CD具有免疫學(xué)活性。S.lividans[pSGLgpp/KDR-ED]可能分泌表達37KD的重組KDR-ED。此外在大腸桿菌中也分別進行了KDR-ED和KDR-CD編碼基因的克隆表達。將KDR-CD基因克隆至載體pET-30a，獲得重組質(zhì)粒pET-30a/KDR-CD并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析

7、顯示在41kD處有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，大部分以包涵體的形式存在。采用磷酸化的酪氨酸抗體進行Western blot檢測，全菌及超聲破碎的上清和包涵體均在41kD處有單一雜交帶，說明表達的KDR-CD重組蛋白具有免疫活性。將KDR-ED基因分別采用載體pET-30a和載體pBV220，在大腸桿菌中均未獲表達。 分別對鏈霉菌和大腸桿菌表達的重組KDR-CD蛋白進行純化。S．lividans[pSGLgpp/KDR-CD]的培養(yǎng)上清液

8、經(jīng)70％飽和硫酸銨沉淀、SP SepharoseFF陽離子交換樹脂層析和Q Sepharose FF陰離子交換樹脂層析，獲得KDR-CD純品。Ecoli[pET-30a/KDR-CD]產(chǎn)生的重組蛋白，經(jīng)尿素溶解再進行復(fù)性處理后，進行Ni<'2+>-螯合親和層析得到具有免疫活性的純化重組蛋白。兩種宿主表達的重組的KDR-CD純化后進行SDS-PAGE分析，HPLC檢測純度均達到95％，且具有免疫活性。 采用ELISA方法研究純化的

9、KDR-CD蛋白的酪氨酸激酶活性，以poly(E4Y)為反應(yīng)底物，對反應(yīng)條件包括KDR—CD濃度、底物濃度、ATP及Mg<'2+>和Mn<'2+>的濃度進行了優(yōu)化，結(jié)果表明兩種體系表達的KDR-CD蛋白均具有酪氨酸激酶活性。 以純化的KDR-CD蛋白為靶位，建立了KDR酪氨酸激酶的抑制劑篩選模型，已篩選了600余株微生物產(chǎn)物，經(jīng)復(fù)篩獲得了13株產(chǎn)生抑制物質(zhì)的菌株，陽性率為2.17％。 本研究首次在鏈霉菌中成功分泌表達了K