人血管內(nèi)皮生長因子受體3結(jié)合肽的篩選和鑒定.pdf

1、多肽介導的靶向性藥物的設(shè)計策略是近年來提高藥物在病灶組織的富集度，增加藥物療效、降低藥物用量和毒副作用的有效方法。一個良好的多肽導向性藥物的發(fā)現(xiàn)需要兩方面條件，首先是特異性的藥物靶點。血管內(nèi)皮生長因子受體3（vascular epithelia growth factor receptor 3,VEGFR-3）正是這樣一個藥物靶點。VEGFR-3 是III 型酪氨酸激酶受體家族的新成員，作為第一個被鑒定出的淋巴管標記物，它對于胚胎期心血

2、管和淋巴管的發(fā)育具有重要意義；在成年人體中，VEGFR-3主要分布于淋巴管內(nèi)皮細胞上，它對于淋巴管形態(tài)完整性的維持和淋巴管正常功能的發(fā)揮具有重要作用。VEGFR-3與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，特別是在腫瘤的診斷、治療和預后評估方面。大量的研究結(jié)果一致地認為VEGFR-3在多種腫瘤中表達量增高，并且對于判斷腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及預后是否良好具有重要意義。一些動物實驗還表明抑制VEGFR-3和其配體的結(jié)合可以有效抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。這些

3、研究結(jié)果提示VEGFR-3是腫瘤診斷和治療中一個具有良好前景的藥物靶標分子。 有了良好的藥物靶點，多肽導向性藥物設(shè)計的第二個條件就是需要有一個能夠特異性識別該靶點的分子作為導向性分子。噬菌體呈現(xiàn)肽庫技術(shù)是近20年來發(fā)展很快的一項技術(shù)，它已成為尋找導向性分子的有效工具。 本實驗中，我們以VEGFR-3為靶蛋白，從噬菌體呈現(xiàn)隨機環(huán)7肽庫中篩選與之結(jié)合的肽，經(jīng)過三輪生物淘篩和噬菌體ELISA，我們獲得了29個陽性重組噬菌體克

4、隆。DNA 測序及根據(jù)DNA 序列推導出的短肽的序列表明29 個克隆中含有1 個共同的短肽序列CSDxxHxWC。BLAST 未發(fā)現(xiàn)該肽序列與任何已知蛋白具有有意義的同源性（包括VEGFR-3的兩個天然配體VEGF-C 和VEGF-D）。在噬菌體ELISA 實驗中，表現(xiàn)最優(yōu)的噬菌體被命名為Phage1。體外實驗表明Phage1可以特異性的和VEGFR-3結(jié)合而不與VEGFR-1 或VEGFR-2 結(jié)合，并且與VEGFR-3 的結(jié)合呈現(xiàn)劑

5、量依賴性。在用流式細胞術(shù)篩選出了VEGFR-3陽性的細胞后，我們選擇其中的一株陽性細胞-人結(jié)腸癌細胞HT29 細胞皮下接種裸鼠，構(gòu)建荷瘤動物模型。 噬菌體在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布實驗表明，歸巢于腫瘤組織的噬菌體Phage1是對照噬菌體的2.38 倍,說明Phage1 在腫瘤組織中有一定程度的特異性富集。 為了進一步證明Phage1 呈現(xiàn)的陽性多肽（命名為P1）在脫離了噬菌體之后仍具有特異性識別VEGFR-3的性質(zhì)，我們用

6、化學合成的方法合成了P1以及對照多肽P5，同時合成了兩種多肽對應的FITC標記的產(chǎn)物。ELISA實驗表明P1 可以特異性的與VEGFR-3 結(jié)合而不與VEGFR-1 或VEGFR-2結(jié)合，并且與VEGFR-3 的結(jié)合呈現(xiàn)劑量依賴性。這與前面Phage1 的實驗結(jié)果是一致的。細胞實驗表明FTIC-P1可以與VEGFR-3陽性的細胞（HT29細胞、Y79 細胞）結(jié)合，和VEGFR-3 弱陽性的細胞（A549 細胞）微弱的結(jié)合，而和VEGFR

7、-3 陰性（Wish 細胞、EVC304 細胞和HepG2 細胞）不結(jié)合，其行為與抗VEGFR-3單克隆抗體的行為一致。激光共聚焦結(jié)果顯示FTIC-P1 結(jié)合于VEGFR-3 陽性細胞的細胞膜上，符合VEGFR-3 在細胞上的分布特點。在競爭實驗中呈現(xiàn)P1的噬菌體Phage1可以特異性的抑制P1與VEGFR-3 的結(jié)合，而且P1 亦可以特異性的阻斷FTIC-P1 與VEGFR-3陽性細胞的結(jié)合。這些實驗結(jié)果強烈提示P1在脫離了噬菌體之后

8、仍然具有特異性識別VEGFR-3的性質(zhì)。同樣的，用VEGFR-3陽性的細胞構(gòu)建荷瘤小鼠模型，體內(nèi)分布實驗表明相對于對照多肽FTIC-P5，F(xiàn)TIC-P1在腫瘤組織中有特異性匯集。 在上述實驗的基礎(chǔ)上，我們還初步研究了P1介導其它分子與VEGFR-3結(jié)合的能力。我們用基因工程的方法構(gòu)建了表達hIFN-α2a-P1的融合基因。 經(jīng)大腸桿菌表達，hIFN-α2a-P1融合蛋白大部分以可溶形式表達。親和層析純化后測定其體外活性