血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞治療肢體缺血.pdf

1、研究背景和目的：隨著人們飲食習(xí)慣的改變、生活水平的提高以及壽命的延長，外周動脈疾病的發(fā)病率逐年升高，尤其是下肢缺血性疾病已經(jīng)成為危害人類健康的嚴(yán)重疾病。目前針對下肢缺血性疾病主要手段是藥物、外科手術(shù)以、腔內(nèi)治療等。但是對于遠(yuǎn)端流出道嚴(yán)重狹窄尤其是合并糖尿病的患者往往沒有手術(shù)機會，目前還缺乏令人滿意的治療方法。應(yīng)用各種方法和手段促進(jìn)新生血管生成，促進(jìn)缺血肢體側(cè)枝循環(huán)的建立，是有效可行的研究方向之一。干細(xì)胞治療和基因治療是目前治療缺血性疾病

2、的兩大熱點。 干細(xì)胞是一類具有無限的或者永生的自我更新能力的細(xì)胞，能夠產(chǎn)生至少一種類型的、高度分化的子細(xì)胞。一般來說，在干細(xì)胞和其終末分化的子代細(xì)胞之間存在著被稱為“定向祖細(xì)胞”的中間祖細(xì)胞群，它們具有有限的擴(kuò)增能力和限制性分化潛能。在體外，干細(xì)胞具有自我更新及分化成器官特定的細(xì)胞類型的能力，當(dāng)置于體內(nèi)，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下則能重構(gòu)器官系統(tǒng)。對干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化，獲取血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)并以適當(dāng)?shù)姆绞揭浦驳襟w內(nèi)，則有望在機體

3、的血管新生中發(fā)揮重要作用。而VEGF基因的治療性血管新生作用也已經(jīng)得到證實。VEGF能增加小血管的通透性、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并能刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活物，從而有力地促進(jìn)血管新生。 與成體組織相比，干細(xì)胞移植的優(yōu)勢之一即在于其易于改造，可以作為基因治療良好的靶細(xì)胞。因此將干細(xì)胞治療與基因(如VEGF)治療聯(lián)系起來治療缺血性疾病是一種有前途的方法。因此，我們設(shè)想利用血管內(nèi)皮祖細(xì)胞作為VEGF基因的載體，

4、同時發(fā)揮干細(xì)胞及VEGF的促血管新生作用來改善缺血肢體的血供。本實驗提取新西蘭兔骨髓單個核細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化成血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，然后體外行VEGF165基因轉(zhuǎn)染，移植到下肢缺血的新西蘭兔體內(nèi)，觀測其促進(jìn)血管新生，改善肢體缺血的效果。為干細(xì)胞及基因治療在缺血性疾病的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 研究內(nèi)容和方法1.新西蘭兔髂嵴穿刺抽取骨髓，F(xiàn)icoll離心液梯度離心分離骨髓單個核細(xì)胞，然后用含有VEGF、bFGF、IGF-1的M199培養(yǎng)液

5、誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs，探索誘導(dǎo)分化所需要的誘導(dǎo)劑量、接種密度等條件。 2.光鏡觀察在誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞形態(tài)的變化，觀察是否有內(nèi)皮細(xì)胞的特征性變化。掃描電鏡及透射電鏡觀察所培養(yǎng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。應(yīng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗體vWF抗體及CD133抗體行間接免疫熒光實驗，從不同角度對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 3.用攜帶VEGF基因的腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所培養(yǎng)的細(xì)胞，觀察不同轉(zhuǎn)染比率對細(xì)胞增殖的影響，探索合適的轉(zhuǎn)染比率。 4.以MTT法觀

6、察攜帶VEGF基因的腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對于培養(yǎng)細(xì)胞增殖能力的影響；雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測上清液中VEGF蛋白的表達(dá)情況。 5.制作新西蘭兔后肢缺血模型，結(jié)扎切斷股動脈主干及其主要分支，觀察術(shù)后實驗兔的皮溫等體征變化，并行CTA檢查檢測缺血效果。 6.將后肢缺血的新西蘭兔隨機分為A、B、C三組，缺血肢體肌肉注射行細(xì)胞移植。A組注射EPCs；B組注射VEGF165基因轉(zhuǎn)染后的EPCs；C組注射M199培養(yǎng)基，行下肢C

7、TA檢查，觀察缺血肢體側(cè)枝循環(huán)建立及血供改善情況，并取患肢腓腸肌做石蠟切片，計數(shù)新生毛細(xì)血管數(shù)目。觀察移植術(shù)后各組新西蘭兔皮溫及其他癥狀、體征的變化。 7.部分培養(yǎng)細(xì)胞Brdu標(biāo)記后移植，患肢腓腸肌做冰凍切片應(yīng)用Brdu抗體行免疫組化實驗，觀測移植細(xì)胞是否整合到缺血局部。 研究結(jié)果1.血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化、培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定兔骨髓單個核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)48～72h后即可見有細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞逐漸增多，并逐漸變成梭形。培養(yǎng)至8

8、天左右，可觀察到數(shù)條由梭形貼壁細(xì)胞直線生長連接而成的條索，為內(nèi)皮細(xì)胞的特征。7～10天出現(xiàn)多個細(xì)胞團(tuán)，貼壁的梭形細(xì)胞開始從細(xì)胞團(tuán)的邊緣出芽長出，這種結(jié)構(gòu)類似血島。培養(yǎng)至14天左右，細(xì)胞逐漸融合，連接成大片條索狀結(jié)構(gòu)。透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)可見細(xì)胞核、線粒體、空泡，并可見多個吞飲泡，為內(nèi)皮細(xì)胞特征性結(jié)構(gòu)，細(xì)胞邊緣可見微絨毛。vWF抗體作一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗，熒光顯微鏡下可見梭形細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，CD133抗體作一抗，TRITC標(biāo)記二抗，熒光

9、顯微鏡下可見梭形細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，證實所培養(yǎng)細(xì)胞為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。 2.Adv-GFP-VEGF165基因轉(zhuǎn)染EPCs結(jié)果轉(zhuǎn)染攜帶綠色熒光蛋白表達(dá)基因的Adv-GFP-VEGF165后24h在熒光顯微鏡下觀察，見幾乎所有細(xì)胞呈綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染成功。增殖實驗及細(xì)胞形態(tài)觀察證實1∶50是合適的轉(zhuǎn)染比率。MTT實驗觀察轉(zhuǎn)染Adv-GFP-VEGF165后EPCs的增殖未受影響。雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測轉(zhuǎn)染VEGF165后的

10、EPCs其上清液中VEGF蛋白濃度明顯升高。 3.細(xì)胞移植實驗結(jié)果移植后各組CTA顯示EPCs組及VEGF基因轉(zhuǎn)染的EPCs組有較多的側(cè)枝循環(huán)建立，均明顯好于對照組，而VEGF基因轉(zhuǎn)染的EPCs組又好于EPCs組。免疫組化結(jié)果與之相似，各組之間新生毛細(xì)血管數(shù)目均有顯著性差異(P＜0.01)，以VEGF基因轉(zhuǎn)染的EPCs組新生毛細(xì)血管數(shù)目最多，高于EPCs組，而后者又明顯高于對照組。EPCs移植組及VEGF基因轉(zhuǎn)染的EPCs組移植

11、后第14d、28d兩個時間點皮溫與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，且與對照組相比有較低的組織壞死率，其中VEGF基因轉(zhuǎn)染的EPCs組組織壞死率最低。VEGF基因轉(zhuǎn)染的EPCs組移植后有6例出現(xiàn)一過性肢體水腫。Brdu標(biāo)記的細(xì)胞移植后，患肢腓腸肌冰凍切片免疫組化染色檢測到棕褐色細(xì)胞，證實移植細(xì)胞整合到了缺血局部。 結(jié)論1.用VEGF、bFGF、IGF-1誘導(dǎo)培養(yǎng)梯度離心法分離的骨髓單個核細(xì)胞，是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的一個簡便

12、可行的方法。其中VEGF是誘導(dǎo)的關(guān)鍵性因子，其濃度不應(yīng)低于20ng/ml。 2.轉(zhuǎn)染比率(細(xì)胞：病毒)1∶50是EPCs轉(zhuǎn)染VEGF165基因的合適比率，過高的轉(zhuǎn)染比率會抑制EPCs的增殖，并造成細(xì)胞損傷。 3.VEGF165基因轉(zhuǎn)染后，對血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖無明顯影響。 4.血管內(nèi)皮祖細(xì)胞具有分泌VEGF的能力，而轉(zhuǎn)染VEGF165后的EPCs上清液中VEGF蛋白濃度明顯增加。 5.血管內(nèi)皮祖細(xì)胞移植能