HGF基因轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細胞促進血管生成的動物實驗研究.pdf

1、目的:
　　體外條件下從大鼠骨髓中分離出單個核細胞，使用特定的培養(yǎng)基使其向內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)分化生長，以Ad-GFP缺陷性腺病毒為載體將HGF基因轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠血管內(nèi)皮祖細胞，之后注入缺血后肢裸鼠體內(nèi)，觀察其體內(nèi)血管生成能力。
　　方法:
　　1.取4-6周齡Wistar大鼠(120-150g)雙下肢股骨及脛骨骨髓，利用密度梯度離心法分離單個核細胞，并使

2、用10％胎牛血清(FBS)DMEM誘導培養(yǎng)，使其分化為血管內(nèi)皮祖細胞。
　　2.以缺陷性腺病毒(Ad-GFP)為載體介導HGF基因轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細胞并計算轉(zhuǎn)染效率。
　　3.建立裸鼠缺血后肢模型后，將裸鼠分為3組，分別為空白對照組、EPCs組、HGF病毒轉(zhuǎn)染EPCs組(Ad-HGF-EPCs)，損傷后即刻及24h后分別將生理鹽水、內(nèi)皮祖細胞、攜帶HGF基因的EPCs以2×108cells細胞數(shù)由尾靜脈注入裸鼠尾靜脈?？刂聘魇?/p>

3、都輸入同樣生理鹽水。觀察期缺血肢體表現(xiàn)，ELISA檢測血清HGF表達水平，激光多普勒(LDPI)檢測血流灌注，CD31免疫組化檢測毛細血管密度。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離和培養(yǎng)出大鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細胞，EPCs攝取Dil-acLDL、結(jié)合FITC-UEA-1雙熒光細胞陽性率為(88.0±5.0)％。
　　2.成功將HGF基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細胞，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達，轉(zhuǎn)染72h后，轉(zhuǎn)染效率高達8

4、0％以上。
　　3.實驗中成功建立缺血后肢模型。術(shù)后2天，三組裸鼠缺血后肢功能評分迅速升至高峰，證實建模成功。HGF基因轉(zhuǎn)染EPCs移植后，肢體自截率及壞死率明顯降低，缺血后肢功能評分明顯較EPCs組低，證實移植后有利于肢體存活和功能恢復。而且ELISA證實Ad-HGF-EPCs移植后體內(nèi)HGF蛋白持續(xù)高表達，術(shù)后2天后即達峰值，此后逐漸降低，但仍高于未轉(zhuǎn)染EPCs移植及空白對照，并至少持續(xù)21天。激光多普勒及CD31免疫組化檢測