CXCR7促進(jìn)人臍帶血來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞血管生成的研究.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cell，EPC)在生理性和病理性血管生成中起關(guān)鍵作用。EPC募集歸巢到血管新生部位，參與血管生成的過(guò)程受到眾多生化因子的調(diào)控。其中，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(Stromal cell derived factor1，SDF-1)在EPC存活、動(dòng)員、歸巢及摻入缺血部位形成血管中起重要作用。一直以來(lái)，SDF-1被認(rèn)為是通過(guò)其唯一受體CXCR4調(diào)控EPC參與血管生成，但最近人們發(fā)現(xiàn)SDF

2、-1的另一個(gè)作用受體-CXCR7。CXCR7廣泛表達(dá)于造血系統(tǒng)，心、腦、脾、肺、腎、睪丸和卵巢等器官和多種腫瘤細(xì)胞系，并且與SDF-1的結(jié)合能力強(qiáng)于CXCR4。CXCR7的發(fā)現(xiàn)讓人們開(kāi)始重新審視SDF-1的作用機(jī)制。已有的研究發(fā)現(xiàn)：CXCR7能夠促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、粘附與跨內(nèi)皮遷移，在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞成熟和干細(xì)胞歸巢中起重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)CXCR7在EPC中表達(dá)，但其功能尚不明確。研究CXCR7在EPC中的功能，對(duì)了解血管

3、生成意義重大。本研究以人臍帶血來(lái)源EPC為研究對(duì)象，考察CXCR7對(duì)EPC參與血管生成的影響，并初步探討其作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，考察通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染的方法提高EPC細(xì)胞CXCR7表達(dá)增強(qiáng)EPC血管生成能力的可行性。本文的主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　 ①人臍帶血來(lái)源EPC的分離培養(yǎng)鑒定。采用密度梯度離心法從新生兒臍帶血中分離單個(gè)核細(xì)胞，并結(jié)合差時(shí)貼壁法，經(jīng)EGM-2內(nèi)皮特異性培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)后，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、特異性表面標(biāo)記和內(nèi)皮功能鑒定E

4、PC。分離出的單個(gè)核細(xì)胞在EGM-2完全培養(yǎng)：基中誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，細(xì)胞形態(tài)呈圓形或者“鵝卵石”狀，并且能夠形成典型的細(xì)胞集落。細(xì)胞免疫熒光顯示：培養(yǎng)7天后的單個(gè)核細(xì)胞CD133及VEGFR-2的陽(yáng)性率均極高，CD133及VEGFR-2雙陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量90％以上，表明分離出的單個(gè)核細(xì)胞中有超過(guò)90％的細(xì)胞為EPC。乙?；兔芏戎鞍讛z取和荊豆凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示：培養(yǎng)7天后的單個(gè)核細(xì)胞有超過(guò)80％的呈Dil-ac-LDL和FITC-U

5、EA-1雙陽(yáng)性，表明分離出的細(xì)胞有較好的內(nèi)皮功能。以上結(jié)果表明：通過(guò)密度梯度離心結(jié)合差時(shí)貼壁法，通過(guò)EGM-2內(nèi)皮特異性培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，能夠從人臍帶血中分離出EPC，并且分離出的細(xì)胞純度高、活性好。
　　 ②考察CXCR7在EPC中的表達(dá)及功能。Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CXCR7在人臍帶血來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞中有表達(dá)。與作為陽(yáng)性對(duì)照的Hela細(xì)胞相比，其表達(dá)較低。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CXCR7主要分布在人臍帶血來(lái)源EPC

6、胞內(nèi)，而在細(xì)胞膜上幾乎不表達(dá)。通過(guò)小分子拮抗劑預(yù)處理EPC阻斷CXCR7，我們考察了CXCR7在SDF-1誘導(dǎo)的EPC遷移、增殖、存活、與活化內(nèi)皮粘附、跨內(nèi)皮遷移、管樣結(jié)構(gòu)形成以及NO和MMP-2分泌中的作用。結(jié)果顯示：CXCR7單獨(dú)介導(dǎo)SDF-1誘導(dǎo)的EPC存活，與CXCR4一同介導(dǎo)EPC誘導(dǎo)的管樣結(jié)構(gòu)形成和MMP-2分泌，還能促進(jìn)SDF-1/CXCR4誘導(dǎo)的EPC與活化內(nèi)皮細(xì)胞粘附和跨內(nèi)皮遷移能力，但在SDF-1誘導(dǎo)的EPC遷移、增

7、殖和NO合成中不起作用。
　　 ③利用Ad-EASY腺病毒質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建CXCR7高表達(dá)腺病毒。從G2細(xì)胞總RNA中反轉(zhuǎn)錄cDNA，利用CXCR7特異性全長(zhǎng)引物擴(kuò)增CXCR7 cDNA全長(zhǎng)序列。將CXCR7全長(zhǎng)序列與pMD19-T質(zhì)粒連接并測(cè)序。以該質(zhì)粒為模板，利用帶酶切位點(diǎn)CXCR7全長(zhǎng)引物擴(kuò)增出帶酶切位點(diǎn)的CXCR7 cDNA全長(zhǎng)序列。分別雙酶切CXCR7全長(zhǎng)序列和穿梭質(zhì)粒pAD Track-CMV，T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)

8、染DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，卡那霉素(Kan)篩選陽(yáng)性菌。抽提重組穿梭質(zhì)粒并測(cè)序以確定CXCR7全長(zhǎng)序列正確擴(kuò)增。將重組穿梭質(zhì)粒用PmeⅠ線性化后，電轉(zhuǎn)入含有AdEASY-1骨架質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，Kan篩選陽(yáng)性菌。抽提質(zhì)粒通過(guò)PacⅠ酶切篩選重組子，并通過(guò)測(cè)序確定重組子中CXCR7全長(zhǎng)序列正確擴(kuò)增。PacⅠ酶切重組質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝病毒。收集病毒進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，驗(yàn)證CXCR7高表達(dá)腺病毒構(gòu)建成功

9、，并篩選轉(zhuǎn)染EPC最佳MOI。測(cè)序和PCR鑒定結(jié)果顯示CXCR7高表達(dá)腺病毒構(gòu)建成功，其轉(zhuǎn)染EPC的最佳MOI。為100。
　　 ④考察提高EPC中CXCR7表達(dá)對(duì)EPC血管生成能力的影響。利用自行構(gòu)建的CXCR7高表達(dá)腺病毒，以MOI=100轉(zhuǎn)染EPC構(gòu)建CXCR7high-EPC工程細(xì)胞。WesternBlotting驗(yàn)證腺病毒轉(zhuǎn)染后EPC中CXCR7的表達(dá)變化。通過(guò)比較CXCR7high-EPC與轉(zhuǎn)染空腺病毒的EPC(wt

10、-EPC)在細(xì)胞存活、與活化內(nèi)皮細(xì)胞粘附、在SDF-1誘導(dǎo)下的跨內(nèi)皮遷移以及體外形成管樣結(jié)構(gòu)的能力，考察提高EPC中CXCR7表達(dá)能否增強(qiáng)其血管生成能力。結(jié)果顯示：CXCR7高表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染能夠顯著提高EPC細(xì)胞CXCR7表達(dá)。提高CXCR7的表達(dá)能夠提高EPC在血清剝奪環(huán)境下的存活，促進(jìn)EPC與活化內(nèi)皮的粘附、SDF-1誘導(dǎo)的跨內(nèi)皮遷移以及管樣結(jié)構(gòu)形成，并且這種促進(jìn)作用與外源性補(bǔ)充SDF-1有協(xié)同作用。
　　 綜合以上結(jié)果，我

11、們得出以下結(jié)論：CXCR7在人臍帶血來(lái)源EPC中低表達(dá)，且主要分布在細(xì)胞胞內(nèi)，在細(xì)胞膜上幾乎不表達(dá)。CXCR7單獨(dú)介導(dǎo)SDF-1誘導(dǎo)的EPC存活，與CXCR4一同介導(dǎo)EPC誘導(dǎo)的管樣結(jié)構(gòu)形成和MMP-2分泌，并促進(jìn)SDF-1/CXCR4誘導(dǎo)的EPC與活化內(nèi)皮細(xì)胞粘附和跨內(nèi)皮遷移，但在SDF-1誘導(dǎo)的EPC遷移、增殖和NO合成中不起作用。通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染提高EPC中CXCR7表達(dá)能夠提高EPC在血清剝奪環(huán)境下的存活、與活化內(nèi)皮的粘附、跨內(nèi)皮