VEGF促進(jìn)臍帶組織來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖作用機(jī)制的研究.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是指出生后機(jī)體中存在能特異性歸巢至血管新生組織并分化成內(nèi)皮細(xì)胞的一群干細(xì)胞，包括從成血-血管干細(xì)胞到完全分化的內(nèi)皮細(xì)胞之間一定階段的細(xì)胞群體，它不僅參與胚胎時(shí)期血管生成，還與損傷的血管內(nèi)皮的愈合和血管新生密切相關(guān)。內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在骨髓中與周圍基質(zhì)細(xì)胞緊密接觸，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓中動(dòng)員而出，此后循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的增殖

2、和分化歸巢至外周組織進(jìn)行損傷的修復(fù)。近來(lái)的多項(xiàng)研究顯示，EPC是參與出生后生理性及病理性血管形成最主要的細(xì)胞。因此，內(nèi)皮祖細(xì)胞在心腦血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療主要包括三個(gè)領(lǐng)域，包括損傷血管壁的修復(fù)、缺血組織新血管形成與再生以及人造血管的包被。限制其臨床應(yīng)用的一個(gè)最主要的原因是從骨髓和外周血中分離培養(yǎng)出EPC數(shù)量都非常有限，不能滿足實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用的

3、需要。解決這個(gè)問(wèn)題的途徑包括應(yīng)用臍帶血或臍帶組織培養(yǎng)人內(nèi)皮祖細(xì)胞，或者用細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、藥物來(lái)促進(jìn)人內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員。
　　 因此，對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)方法的研究仍然很有必要。為了培養(yǎng)擴(kuò)增出大量穩(wěn)定的內(nèi)皮祖細(xì)胞，本研究參照國(guó)內(nèi)外多家實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)及鑒定方案，在實(shí)驗(yàn)中反復(fù)摸索，對(duì)影響EPC培養(yǎng)擴(kuò)增的部分重要因素進(jìn)行比較，通過(guò)對(duì)人骨髓、臍帶血、臍帶組織培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的比較，以及分別用不同濃度VEGF與EPC共培養(yǎng)研究VEGF對(duì)人內(nèi)皮祖

4、細(xì)胞動(dòng)員的促進(jìn)作用，進(jìn)而選擇培養(yǎng)獲得率高、祖細(xì)胞特征穩(wěn)定以及增殖能力、成血管能力都較強(qiáng)的人內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)方案，為下一步移植內(nèi)皮祖細(xì)胞用于治療心血管疾病及多器官功能障礙綜合癥奠定良好的基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究共分三部分：
　　 第一部分：不同組織來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
　　 目的：通過(guò)對(duì)人骨髓、臍帶血、臍帶組織培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的比較，建立起人EPC的標(biāo)準(zhǔn)化分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法，為內(nèi)皮祖細(xì)胞的移植奠定基礎(chǔ)。<

5、br>　　 方法：采用密度梯度差速貼壁培養(yǎng)法及組織塊植塊法，分別從骨髓、臍帶血及臍帶組織中分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，按照不同接種密度、換液時(shí)間、基礎(chǔ)培養(yǎng)液、血清濃度等進(jìn)行分組，比較原代EPC細(xì)胞集落個(gè)數(shù)及EPC獲得率，成熟后EPC通過(guò)比較細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線及增殖倍數(shù)，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)、分析、比較。
　　 結(jié)果：通過(guò)各種不同培養(yǎng)條件及方法得到的EPC細(xì)胞形態(tài)基本相似。骨髓來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞在連續(xù)傳代3代以后，細(xì)胞形

6、態(tài)即發(fā)生明顯改變，而臍帶血及臍帶組織來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞可穩(wěn)定傳代10代以上，細(xì)胞形態(tài)不發(fā)生明顯改變。臍帶組織及臍帶血來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞較骨髓來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞祖細(xì)胞形態(tài)特征穩(wěn)定且增殖能力較強(qiáng)。
　　 結(jié)論：從骨髓、臍帶血及臍帶組織中能成功分離培養(yǎng)出內(nèi)皮祖細(xì)胞，并能傳代擴(kuò)增。臍帶組織及臍帶血來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞較骨髓來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)特征穩(wěn)定且增殖能力較強(qiáng)。臍帶組織來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞獲得率較高且培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便、可靠，可為最終臨

7、床應(yīng)用于防治多器官功能障礙做準(zhǔn)備。
　　 第二部分:內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定與功能檢測(cè)
　　 目的：鑒定培養(yǎng)擴(kuò)增出的人內(nèi)皮祖細(xì)胞并測(cè)定其功能，保證所分離及培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞的性質(zhì)及純度。
　　 方法：通過(guò)采用細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察，用攝取Dil標(biāo)記的人乙?；兔芏戎鞍?Dil-ac-LDL)與FITC標(biāo)記的特異性荊豆凝集素(FITC-UEA-1)的雙色熒光染色法和用CD133、CD34、CD31、KDR等表型表達(dá)行免疫組

8、化鑒定EPC及流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)EPC純度以及體外血管生成功能試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，對(duì)人骨髓、臍帶血、臍帶組織培養(yǎng)的人內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)符合內(nèi)皮祖細(xì)胞特征，Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1雙染超過(guò)80％，免疫組化、流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133、CD34、CD31、KDR等的陽(yáng)性率均符合EPC表型特征；體外具有成血管能力。
　　 結(jié)論：本研究采用綜合的鑒定體系(形態(tài)特征、流式細(xì)胞

9、儀、雙色熒光、體外血管生成功能試驗(yàn))所得結(jié)果完全可證明我們培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞為人內(nèi)皮祖細(xì)胞。臍帶組織來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞及臍帶血來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞與骨髓來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞相比祖細(xì)胞特征穩(wěn)定且成血管能力較強(qiáng)。
　　 第三部分:VEGF促進(jìn)臍帶組織來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖作用機(jī)制的研究
　　 目的：研究VEGF促進(jìn)人臍帶組織來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖作用機(jī)制。
　　 方法：比較不同濃度VEGF與人臍帶組織來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞共培養(yǎng)后內(nèi)

10、皮祖細(xì)胞數(shù)量變化及細(xì)胞培養(yǎng)液一氧化氮(NO)含量。用PI3K的特異性抑制劑LY294002處理臍帶EPCs，同時(shí)設(shè)空白組和溶劑(DMSO)對(duì)照組和10ng/mlVEGF+抑制劑LY294002組，用westernblot檢測(cè)磷酸化Akt蛋白的表達(dá)，硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液一氧化氮(NO)含量，檢測(cè)加入抑制劑后細(xì)胞增殖能力及成血管能力。
　　 結(jié)果：10ng/ml濃度的VEGF與人臍帶組織來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞共培養(yǎng)后內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量明

11、顯增加，細(xì)胞培養(yǎng)液一氧化氮(NO)含量明顯提高，而20ng/ml濃度的VEGF與人臍帶組織來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞共培養(yǎng)后內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞培養(yǎng)液一氧化氮(NO)含量與10ng/ml濃度相比變化不明顯。加入PI3K的特異性抑制劑LY294002抑制PI3K后，磷酸化Akt蛋白表達(dá)也明顯減少；細(xì)胞培養(yǎng)液NO含量明顯減少；細(xì)胞增殖能力及成血管能力明顯下降。
　　 結(jié)論：10ng/ml的VEGF濃度對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖具有明顯促進(jìn)作用，同時(shí)

12、培養(yǎng)液中NO濃度明顯增高。而20ng/ml濃度的VEGF與10ng/ml濃度的VEGF相比對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用不明顯，可能與受體飽和有關(guān)。加入PI3K的特異性抑制劑LY294002抑制PI3K后，磷酸化Akt蛋白表達(dá)也明顯減少；細(xì)胞培養(yǎng)液NO含量明顯減少；細(xì)胞增殖能力及成血管能力明顯下降，提示VEGF通過(guò)PI3K/Akt/eNOS通路促進(jìn)人內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖。
　　 總之，通過(guò)對(duì)人骨髓、臍帶血、臍帶組織培養(yǎng)人內(nèi)皮祖細(xì)胞的比

13、較發(fā)現(xiàn)臍帶組織及臍帶血來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞較骨髓來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)及祖細(xì)胞特征穩(wěn)定且臍帶組織及臍帶血來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力及成血管能力均強(qiáng)于骨髓來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞，且臍帶組織來(lái)源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞獲得率較高且培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便、可靠。通過(guò)分別用不同濃度VEGF與人臍帶組織來(lái)源的EPC共培養(yǎng)研究VEGF對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用發(fā)現(xiàn)10ng/ml的VEGF濃度對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖具有明顯促進(jìn)作用，同時(shí)培養(yǎng)液中NO濃度明顯增高，加入PI3