小鼠骨髓高增殖潛能內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)與促增殖因子研究.pdf

1、目的：用含小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞系條件培養(yǎng)液（BMEC—CM）的培養(yǎng)體系，進(jìn)行骨髓高增殖潛能內(nèi)皮祖細(xì)胞（HPP—EPC）及其后代細(xì)胞的培養(yǎng)和純化，建立這些細(xì)胞的一種擴(kuò)增培養(yǎng)方法。檢測小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞系細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）mRNA表達(dá)水平，分析BMEC—CM促進(jìn)EPC增殖的分子機(jī)理。 方法和結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)分為以下三個(gè)部分： 1.總EPC集落形

2、成實(shí)驗(yàn)制備小鼠骨髓單細(xì)胞懸液，骨髓細(xì)胞預(yù)貼壁培養(yǎng)6h后，吸出含未貼壁細(xì)胞的上懸液，移入新的培養(yǎng)瓶，并添加BMEC—CM，進(jìn)行二次貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)5d后用胰酶法將貼壁細(xì)胞消化下來，洗滌后計(jì)數(shù)。以每m㎡孔底面積1個(gè)細(xì)胞（1/mm2）的密度，將這些細(xì)胞種入培養(yǎng)板，培養(yǎng)體系中仍添加BMEC—CM。觀察貼壁細(xì)胞集落的形成，計(jì)數(shù)集落數(shù)和計(jì)算集落形成率。數(shù)碼顯微拍攝集落，計(jì)數(shù)集落細(xì)胞數(shù)，用集落平均細(xì)胞數(shù)繪制細(xì)胞生長曲線，并計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間（DT）。

3、 按原代骨髓細(xì)胞種植后的天數(shù)計(jì)，9～12d可見EPC細(xì)胞簇，2～3d內(nèi)形成集落（細(xì)胞數(shù)≥50），集落形成率為每106骨髓有核細(xì)胞生成600.0±52.4個(gè)集落（個(gè)/106NBMCs）。集落細(xì)胞大多呈橢圓形、圓形和紡錘形。大部分集落約在1周內(nèi)生長較快，以后生長減慢，至30d左右，集落平均細(xì)胞數(shù)為504.6±126.0。在原代骨髓細(xì)胞種植后10～13d、14～17d、18～21d、22～25d四個(gè)時(shí)間段的細(xì)胞群體倍增時(shí)間依次是58.

4、0h、74.4h、131.2h、358.2h。 2.HPP—EPC集落形成實(shí)驗(yàn)及單集落源細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)和鑒定用上述消化和洗滌的貼壁細(xì)胞，以每m㎡孔底面積50個(gè)細(xì)胞（50/m㎡）的密度種入培養(yǎng)板，培養(yǎng)體系同前，每周換液。觀察貼壁細(xì)胞集落的形成，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)達(dá)5000左右的集落，計(jì)算集落形成率。進(jìn)行單集落細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，每4d做細(xì)胞計(jì)數(shù)，按單個(gè)集落繪制細(xì)胞生長曲線和計(jì)算DT。用擴(kuò)增細(xì)胞做CD31和vWF免疫熒光染色、FITC—UEA-1

5、結(jié)合實(shí)驗(yàn)和Dil—Ac—LDL攝取實(shí)驗(yàn)。 按原代骨髓細(xì)胞種植后的天數(shù)計(jì)，28～35d時(shí)細(xì)胞數(shù)5000左右的HPP—EPC集落形成，其細(xì)胞緊密聚集，細(xì)胞形態(tài)大多為橢圓形和圓形，集落形成率為3.0±0.6個(gè)/106NBMCs。單集落源細(xì)胞傳代擴(kuò)增培養(yǎng)顯示，細(xì)胞在低密度時(shí)可形成索狀和網(wǎng)狀排列，高密度時(shí)細(xì)胞呈鋪路石狀排列。在原代骨髓細(xì)胞種植后50～53d，DT最短，平均為51.2h；在74～77d時(shí)間段，DT延長至324.2h。至原代骨

6、髓細(xì)胞種植后80d左右，集落的平均細(xì)胞數(shù)達(dá)8.0×106±1.2×105個(gè)，這些細(xì)胞為CD31、vWF免疫熒光染色陽性，能結(jié)合FITC—UEA-1和吞噬Dil—Ac—LDL。 3.mBMEC細(xì)胞中三種細(xì)胞因子mRNA水平的檢測Trizol法提取小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞系細(xì)胞RNA，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，檢測VEGF、bFGF、IGF-1mRNA的表達(dá)水平。PCR結(jié)果顯示mBMEC細(xì)胞高水平表達(dá)VEGFmRNA和bFGFmRNA，