小鼠骨髓源內(nèi)皮祖細胞導向自殺-內(nèi)皮抑素基因治療肝癌的研究.pdf

1、第一部分CD和ES基因慢病毒表達載體的構建與鑒定
　　 目的:分別構建攜帶胞嘧啶脫氨酶（Cytosine Deaminase，CD）和血管內(nèi)皮抑素(Endostatin，ES)基因的慢病毒載體，為進一步進行CD、ES基因治療肝癌奠定基礎。
　　 方法:根據(jù)GeneBank提供的大腸桿菌源CD和ES基因序列設計、合成兩個基因并構建與熒光蛋白融合的真核表達載體pEGFP-CD和pDS-RED-ES。酶切和測序鑒定后，將載體瞬

2、時轉(zhuǎn)染HEK293細胞。運用Real-Time PCR檢測CD和ES基因表達情況。把載體中基因片段EGFP-CD和DS-RED-ES通過BP/LR重組分別構建慢病毒載體，并利用293T細胞進行慢病毒的包裝;將病毒原液濃縮，并測定病毒滴度。
　　 結果:酶切和測序、PCR鑒定證實構建出了慢病毒載體pLenti6.3-CD-EGFP和pLenti6.3-ES-Monomer-DsRed，感染293T細胞后熒光顯微鏡下觀察到GFP和D

3、sRed的表達，濃縮慢病毒滴度分別為2.2*108TU/ml和6.5*107TU/ml。
　　 結論:成功構建了CD和ES基因慢病毒表達載體。
　　 第二部分小鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)鑒定及7.0T磁共振成像研究
　　 目的:應用納米磁粒子Resovist體外標記小鼠骨髓源內(nèi)皮祖細胞(EPCs)，磁共振(MR)對標記細胞成像。
　　 方法:分離小鼠骨髓單個核細胞，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)。免疫熒光及qPCR

4、檢測培養(yǎng)細胞表面標記CD31、KDR、vWF表達，免疫熒光檢測內(nèi)吞Di I標記的乙酰低密度脂蛋白(Di I—AcLDL)和結合F I T C標記的荊豆凝集素(—)1(FITC—UEA—1)的功能，觀察細胞體外基質(zhì)膠中成管情況。Resovist體外標記EPCs，普魯士藍染色顯示細胞內(nèi)鐵。利用7.OT MR進行快速小角度激發(fā)(Fast Low Angle Shot，F(xiàn)lash)2D-FLASH序列和多自旋回波序列(multislice，mu

5、ltiecho，MSME)及不同數(shù)量級標記細胞群成像。
　　 結果:免疫熒光及qPCR顯示培養(yǎng)細胞表達內(nèi)皮細胞標志CD31、KDR、vWF，能結合UEA、內(nèi)吞LDL，體外基質(zhì)膠上可以形成管狀結構。Resovist細胞標記率接近100％，普魯士藍染色鐵染細胞胞漿為藍色、胞核為紅色。MRI顯示標記Resovist的細胞群較未標記者T2*梯度回波序列信號降低，2D-FLASH序列較MSME序列對單細胞成像檢測更敏感。
　　 結

6、論:小鼠骨髓源單個核細胞體外可以誘導培養(yǎng)為內(nèi)皮祖細胞，Resovist能成功標記EPCs，利用MR可以對標記細胞群成像，可用于進一步細胞治療及實時活體監(jiān)測。
　　 第三部分小鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞導向自殺/內(nèi)皮抑素基因治療肝癌的研究
　　 目的:細胞法制作小鼠肝癌模型，慢病毒載體Lenti6.3-CD-EGFP、Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed體外轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源性EPCs，SPIO標記后回輸肝癌小鼠。探討

7、內(nèi)皮祖細胞導向自殺/內(nèi)皮抑素基因治療肝癌的可行性。
　　 方法:體外培養(yǎng)、擴增小鼠骨髓源性EPCs，慢病毒載體Lenti6.3-CD-EGFP、Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed轉(zhuǎn)染、SPIO標記EPCs。觀察體外基質(zhì)膠上細胞成管功能、Millicell細胞遷移小室中細胞遷移能力、CCK-8法檢測各組細胞培養(yǎng)上清對小鼠肝癌細胞H22增殖能力影響。細胞法制作小鼠肝癌模型，尾靜脈注射DID標記EPCs至肝癌小鼠及正常

8、小鼠后不同時間對離體組織進行光學成像觀察EPCs體內(nèi)遷移情況。尾靜脈注射負載自殺/內(nèi)皮抑素基因的EPCs至肝癌模型鼠。實驗分為5組:第1組為移植EPCs+SPIO+LV組，第2組為移植EPCs+SPIO+CD/5-FC組、第3組為EPCs+SPIO+ES組、第4組EPCs+SPIO+CD+ES組和第5組EPCs+SPIO+CD/5-FC+ES組。實驗動物在移植前及移植后7d、14d、21d三個時間點分別隨機取2只進行MR掃描，根據(jù)MR圖

9、像繪制腫瘤生長曲線;進行組織病理學分析、生存分析。
　　 結果:慢病毒載體Lenti6.3-CD-EGFP、Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源性EPCs后熒光顯微鏡下分別可見細胞呈綠色、紅色熒光，共轉(zhuǎn)染后為橙色熒光。EPC+CD+ES組在體外基質(zhì)膠上成管數(shù)及遷移小室中細胞遷移數(shù)量均明顯少于EPC組; EPC+SPIO+CD/5-Fc+ES組細胞上清較EPC及EPC+SPIO+LV組上清液對小鼠肝癌細

10、胞H22體外增殖具有明顯抑制作用。DID標記EPCs后光學成像顯示EPCs尾靜脈注射后短期內(nèi)主要分布于肝，少量依次分布于脾、腎、肺等組織。5組細胞分別通過尾靜脈回輸肝癌小鼠后，EPC+SPIO+CD/5-Fc+ES組較EPC+SPIO+LV組及其他治療組小鼠肝癌腫瘤體積小、增長速度慢，中位生存期延長;腫瘤組織內(nèi)CD31陽性細胞數(shù)量明顯少于EPC+SPIO+LV組、凋亡細胞數(shù)量明顯多于EPC+SPIO+LV組。
　　 結論:負載C