超聲破壞微泡介導內皮抑素基因治療肝癌及其機制研究.pdf

1、第一部分:攜內皮抑素脂質基因超聲微泡的制備
　　第一節(jié):重組人內皮抑素質粒載體的構建、純化及鑒定
　　目的:構建重組人內皮抑素真核表達載體并制備脂質超聲微泡攜帶目的基因。方法:根據(jù)目的基因片段設計引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行擴增并純化，然后將純化的目的基因與pEZ-M46載體分別酶切并進行連接，構建內皮抑素基因重組真核表達載體pEZ-M46-ES，并轉化至大腸肝菌，進行菌落PCR、酶切分析和DNA測序鑒定重組克隆。

2、結果:經雙酶切電泳和DNA測序分析證實，重組克隆載體內的目的基因片段序列與GENEBANK上報道的Endostatin基因序列基本一致，編碼蛋白質的氨基酸序列完全相同。結論:成功構建了人重組內皮抑素基因質粒載體。
　　第二節(jié):微泡基因載體的制備及基本特性檢測
　　目的:研制性能穩(wěn)定、高效的微泡類基因載體以攜帶目的基因。方法;采用成膜水化法、膜擠壓法和機械振蕩法分別制備脂質超聲微泡和納米脂質體，通過生物素-親和素法將微泡-納米

3、脂質體連接起來，以構建載基因量高的微泡類載體；在配方中加入帶正電荷的成膜材料DC-膽固醇(DC-cholesterol)，通過機械振蕩法制備陽離子脂質超聲微泡，光鏡下觀察微泡形態(tài)，并對其體外基本特性(濃度、粒徑、表面電荷)、增強超聲顯像效果、載基因特性等進行考察。結果光鏡下顯示，納米脂質體被成功連接到了脂質微泡表面，然而其連接效率差，濃度過低；成功制備了陽離子脂質超聲微泡，微泡表面形態(tài)規(guī)整，大小均一，分散度好，其濃度、粒徑及表面電荷分別

4、為3.13±0.26×109/ml，1.6+0.29μm，21.07±5.30 mV。在造影模式下，能顯著增強兔肝臟超聲顯像，持續(xù)時間長。普通微泡帶負電荷或不帶電荷，攜帶基因能力低，而陽離子微泡攜帶較多正電荷，載基因量顯著增加。兩者的基因結合率分別為4.33±1.47％和31.45±5.16％。結論納米脂質體-超聲微泡復合物不符合超聲造影劑要求，無法作為基因載體攜帶目的基因聯(lián)合超聲進行下一步的靶向治療研究；陽離子脂質超聲微泡具備超聲造影

5、劑的基本特性，并可成為一種高效的基因載體。
　　第二部分:超聲破壞陽離子微泡介導內皮抑素基因體外細胞轉染實驗
　　第一節(jié):超聲破壞微泡介導內皮抑素基因轉染對臍靜脈內皮細胞生長和血管形成的影響
　　目的:探索超聲破壞微泡介導基因治療的最佳聲學條件，然后以陽離子微泡作為基因載體，聯(lián)合超聲介導內皮抑素基因轉染臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，研究其對細胞生長和血管形成的抑制作用。方法:將pEZ-M46-ES質粒轉化大腸桿菌，采用

6、質粒抽提試劑盒擴增純化質粒，調整質粒濃度為0.1μg/μl進行轉染。收集對數(shù)生長期人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，首先采用不同強度超聲進行分組處理，分別為：0.1、0.2、0.3、0.5 W/cm2，然后將超聲強度固定為0.1 W/cm2，加入不同濃度微泡后聯(lián)合處理，微泡濃度分別為：1、3、5、7×108/ml，根據(jù)細胞存活情況篩選出最佳超聲強度和微泡濃度組合，然后按以下分組對細胞進行處理：①空白對照組(C)，②質粒+脂質體組(P+L)

7、，③質粒+超聲輻照組(P+US)，④質粒+陽離子微泡組(P+US)，⑤質粒+陽離子微泡+超聲輻照組(P+MB++US)。①組以空質粒作為陰性對照，②組以脂質體2000介導基因轉染作為陽性對照，③組觀察單獨超聲基因轉染的影響，④組觀察單獨陽離子微泡介導基因轉染的效果，⑤組測試超聲破壞陽離子微泡介導內皮抑素基因轉染的效果。對各組細胞進行處理后24h，(1)在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染情況，并收集細胞采用流式細胞術檢測轉染效率；以MTT法觀察各

8、組細胞生長情況，計算抑制率；(2)Western blot法檢測各組細胞中Endostatin的表達情況。(3)將HUVEC細胞接種至預先鋪好Matrigel的Ttranswell中，建立體外人造微血管模型，同上進行分組處理，24 h后進行固定、染色，觀察血管網(wǎng)的形成數(shù)量。結果超聲強度為0.1和0.2W/cm2時，細胞存活率未受明顯影響，達到0.3W/cm2時，細胞存活率出現(xiàn)一定程度降低，達到0.5W/cm2時，細胞存活率急劇下降。超聲

9、強度固定為0.1 W/cm2，微泡濃度為7×108/ml時，細胞存活率輕度降低。分組轉染pEZ-M46－ES質粒后，倒置熒光顯微鏡下可觀察P+MB+US組和P+L組均有大量細胞發(fā)出綠色熒光，P+US組和P+MB組僅少數(shù)細胞表達熒光，流式細胞術檢測轉染率各實驗組分別為：31.24±8.3％，12.57±0.67％，3.14±0.72％，30.64±8.5％。MTT檢測結果發(fā)現(xiàn)P+MB+US組和P+L組HUVEC細胞移抑制率顯著高于其他各組

10、，但兩組間差異無顯著性，與對照組比較，各實驗組細胞生長抑制率分別為：33.47±0.67％，15.49±2.56％，3.23±1.97％，35.52±8.67％；轉染pEZ-M46-ES質粒后，western blot法可檢測到轉染內皮抑素基因后細胞內Endostatin的表達。各組HUVEC細胞形成網(wǎng)狀血管結構數(shù)量分別為28.47±3.52，9.17±1.62，22.19±4.33，25.26±5.31，4.42±1.52。結論:最佳

11、超聲強度與微泡濃度組合為0.1 W/cm2+7×108/ml，轉染質粒后，與質粒+超聲或單獨陽離子微泡相比，超聲破壞微泡能顯著增強內皮抑素基因轉染臍靜脈內皮細胞的效率，提高其表達水平，但與脂質體相比，差異無顯著性。轉染內皮抑素基因能夠明顯抑制臍靜脈內皮細胞的生長，并能抑制HUVEC細胞網(wǎng)狀血管結構的形成。
　　第二節(jié):超聲破壞微泡介導內皮抑素基因轉染對HepG2細胞侵襲和轉移特性的影響
　　目的:以陽離子微泡作為基因載體，通

12、過超聲破壞微泡作用介導內皮抑素基因轉染肝癌HepG2細胞，研究內皮抑素對HepG2細胞遷移、侵襲、克隆形成及誘導血管形成能力的影響。方法:常規(guī)培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞，按以下分組進行轉染pEZ－M46-ES質粒：①空白對照組(C)，②質粒+超聲輻照組(P+US)，③質粒+陽離子微泡組(P+MB)，④質粒+陽離子微泡+超聲輻照組(P+MB++US)。處理后通過化痕法、Transwell系統(tǒng)和Matrigel人工基底膜檢測細胞遷移、侵襲情況

13、；通過軟瓊脂集落實驗(Soft agar)觀察各組HepG2細胞增殖形成克隆的能力；將HepG2細胞轉染內皮抑素基因后與HUVEC細胞共培養(yǎng)于Transwell系統(tǒng)，觀察HUVEC細胞血管網(wǎng)形成情況，并以ELISA法檢測HepG2細胞培養(yǎng)上清中VEGF的表達情況。結果: HepG2細胞轉染pEZ-M46－ES質粒，P+MB++US組穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)量和細胞克隆形成的數(shù)量明顯少于其他組，與HUVEC細胞共培養(yǎng)時，誘導血管形成的數(shù)量也

14、低于其他組。P+US組和P+MB組細胞轉染效率較低，與對照組相比，P+US組遷移、侵襲細胞和形成克隆數(shù)量有一定減少，誘導HUVEC形成血管數(shù)量少于對照組，但P+MB組與對照組相比未見明顯改變。ELISA結果顯示，經P+MB++US處理后細胞培養(yǎng)上清中VEGF表達水平最低。結論:超聲破壞微泡介導內皮抑素基因轉染對HepG2細胞遷移、侵襲、克隆形成及誘導血管形成能力具有明顯的抑制作用。
　　第三部分:超聲破壞微泡介導內皮抑素基因對肝癌

15、H22移植瘤生長的影響
　　目的:研究超聲破壞微泡介導內皮抑素基因轉染對肝癌H22移植瘤生長的抑制作用及相關機制。方法:(1)將pEZ－M46－ES質粒與陽離子微泡進行孵育，得到載內皮抑素基因微泡。常規(guī)懸浮培養(yǎng)小鼠H22細胞，離心收集處于對數(shù)生長期細胞，調整細胞濃度，以5.3×107/ml接種至昆明小鼠背部皮下，每只小鼠注射0.2ml腫瘤細胞懸液。(2)經小鼠尾靜脈注射陽離子載基因微泡0.2ml，在超聲造影模式下觀察微泡增強腫瘤顯

16、像情況。(3)將20只荷瘤小鼠隨機分為以下4組分別進行處理：①生理鹽水對照組，②質粒+超聲組，③空白微泡+超聲組，④單獨陽離子載基因微泡組，⑤陽離子載基因微泡+超聲組。微泡經尾靜脈輸注，超聲輻照在注射后立即進行，采用本研究所研制的超聲基因轉染治療儀輻照整個腫瘤部位，輻照條件：1MHz、2W/cm2，輻照10s，間隔5s，共5min。每周處理兩次，連續(xù)三周。首次處理前以游標卡尺測量腫瘤長、短徑，隨后每周測量兩次。然后計算腫瘤體積，描繪生長

17、曲線。實驗結束后，處死小鼠，剝取腫瘤稱重，計算抑瘤率，并以石蠟包埋、切片，通過免疫組化染色，計算腫瘤微血管密度(MVD)結果:在超聲造影模式下，經小鼠尾靜脈注射載基因微泡后5 s，小鼠移植瘤部位出現(xiàn)微泡充盈，10 s達到高峰，增強持續(xù)時間超過10 min。腫瘤生長曲線顯示，超聲破壞載內皮抑素基因微泡治療能明顯抑制腫瘤的生長，該治療組腫瘤體積明顯小于其他組；腫瘤生長明顯較對照組和其他組緩慢，而改組抑瘤率最高，達70.1％。免疫組化結果顯示