超聲造影劑增強超聲輻照介導(dǎo)的肝癌基因治療研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文超聲造影劑增強超聲輻照介導(dǎo)的肝癌基因治療研究專業(yè)：影像醫(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)中消人：湯慶導(dǎo)師：閂明德教授答辯委員會一E席：氣履多答辯委員會委員：耐68026資助項目：國家自然科學(xué)基金(NO：3047046730300082)、廣東省科委重點攻關(guān)項目(NO：2002C31108)和廣東省自然科學(xué)基金(NO：04009360)《》博。I一論文超聲造影劑增強超聲輻照介導(dǎo)肝癌基圳治療的研壅!壅塑重法。步驟如下：無菌臍帶兩端切除少許組織

2、，在臍靜脈一端，插入靜脈輸液硅膠套管，PBs反復(fù)沖洗腔內(nèi)血跡。于靜脈腔內(nèi)注射02％膠原酶II型約15～20m1，消化時問10～12min。PBS灌沈消化后的血管，收集并與消化液一道于1000rpm離心8min。收集沉淀細胞，重懸細胞，臺盼藍試驗檢測細胞活性，置于明膠鋪底的培養(yǎng)瓶內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)生長。2HUVEC的培養(yǎng)24h換新鮮培養(yǎng)基。以后每3d更換培養(yǎng)基，加新鮮培養(yǎng)液3mL。待細胞呈單層密集生長、約覆蓋2／3左右培養(yǎng)面時，按1：2比例傳代。

3、3HUVEC的鑒定倒置光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。采用免疫組化法檢測Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定。熒光DiIAcLDL法活體鑒定。4免疫組化法檢測HUVEC細胞和人肝癌細胞株HepG21_f『L管內(nèi)皮生長因子受體(KDR)的表達。二、結(jié)果1用膠原酶消化獲得的HUVEC總數(shù)平均為lxl06個細胞，最多一次達3x106個?？蓚鞔囵B(yǎng)達到5代以上。2第VIII因子相關(guān)抗原抗體染色，可見95％以上的細胞陽性染色。3DiIAcLDL熒光染色，可見95％以上的活

4、體細胞發(fā)出紅色熒光。4KDR表達HUVEC呈陽性HepG2呈陰性。第二部分超聲造影劑對超聲輻照下血管內(nèi)皮細胞膜通透性作用的影響一、方法1實驗步驟原代HUVEC分離后培養(yǎng)4～5d。重懸細胞，重新放入培養(yǎng)箱內(nèi)3h，使其充分修復(fù)。照射前重懸細胞，按細胞數(shù)為15105／孑L加入自制24孔板，加509lFD500及609l全氟顯。立即進行超聲照射。超聲照射場：依次為探頭一10cm厚的超聲耦合劑一6岬厚聚酯薄膜一細胞懸液69in厚聚酯薄膜一37攝氏

5、度水一吸聲海綿。輻照實驗完畢后再培養(yǎng)4h后，經(jīng)3次PBS洗滌后進行檢測。2實驗分組A組(n=6)：不發(fā)射超聲。B組(”=6)：細胞懸液內(nèi)添加全氟顯60l(02g／m1)，不發(fā)射超聲。c組(月=6)：發(fā)射超聲，輻照時間60秒，探頭頻率19MHz，TIS設(shè)置為O8，輸出聲強IsATA為800mW／cm2。D組(“=6)：添加全氟顯(劑量同B組)，并發(fā)射超聲(輻照條件同c組)。3觀察指標熒光顯微鏡下觀測細胞內(nèi)熒光染色。流式細胞儀檢測染色陽性細