超聲造影劑增強(qiáng)超聲輻照介導(dǎo)的肝癌基因治療研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文超聲造影劑增強(qiáng)超聲輻照介導(dǎo)的肝癌基因治療研究專業(yè)：影像醫(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)中消人：湯慶導(dǎo)師：閂明德教授答辯委員會(huì)一E席：氣履多答辯委員會(huì)委員：耐68026資助項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(NO：3047046730300082)、廣東省科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(NO：2002C31108)和廣東省自然科學(xué)基金(NO：04009360)《》博。I一論文超聲造影劑增強(qiáng)超聲輻照介導(dǎo)肝癌基圳治療的研壅!壅塑重法。步驟如下：無(wú)菌臍帶兩端切除少許組織

2、，在臍靜脈一端，插入靜脈輸液硅膠套管，PBs反復(fù)沖洗腔內(nèi)血跡。于靜脈腔內(nèi)注射02％膠原酶II型約15～20m1，消化時(shí)問(wèn)10～12min。PBS灌沈消化后的血管，收集并與消化液一道于1000rpm離心8min。收集沉淀細(xì)胞，重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性，置于明膠鋪底的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)常規(guī)培養(yǎng)生長(zhǎng)。2HUVEC的培養(yǎng)24h換新鮮培養(yǎng)基。以后每3d更換培養(yǎng)基，加新鮮培養(yǎng)液3mL。待細(xì)胞呈單層密集生長(zhǎng)、約覆蓋2／3左右培養(yǎng)面時(shí)，按1：2比例傳代。

3、3HUVEC的鑒定倒置光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。采用免疫組化法檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定。熒光DiIAcLDL法活體鑒定。4免疫組化法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞株HepG21_f『L管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(KDR)的表達(dá)。二、結(jié)果1用膠原酶消化獲得的HUVEC總數(shù)平均為lxl06個(gè)細(xì)胞，最多一次達(dá)3x106個(gè)。可傳代培養(yǎng)達(dá)到5代以上。2第VIII因子相關(guān)抗原抗體染色，可見(jiàn)95％以上的細(xì)胞陽(yáng)性染色。3DiIAcLDL熒光染色，可見(jiàn)95％以上的活

4、體細(xì)胞發(fā)出紅色熒光。4KDR表達(dá)HUVEC呈陽(yáng)性HepG2呈陰性。第二部分超聲造影劑對(duì)超聲輻照下血管內(nèi)皮細(xì)胞膜通透性作用的影響一、方法1實(shí)驗(yàn)步驟原代HUVEC分離后培養(yǎng)4～5d。重懸細(xì)胞，重新放入培養(yǎng)箱內(nèi)3h，使其充分修復(fù)。照射前重懸細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)為15105／孑L加入自制24孔板，加509lFD500及609l全氟顯。立即進(jìn)行超聲照射。超聲照射場(chǎng)：依次為探頭一10cm厚的超聲耦合劑一6岬厚聚酯薄膜一細(xì)胞懸液69in厚聚酯薄膜一37攝氏

5、度水一吸聲海綿。輻照實(shí)驗(yàn)完畢后再培養(yǎng)4h后，經(jīng)3次PBS洗滌后進(jìn)行檢測(cè)。2實(shí)驗(yàn)分組A組(n=6)：不發(fā)射超聲。B組(”=6)：細(xì)胞懸液內(nèi)添加全氟顯60l(02g／m1)，不發(fā)射超聲。c組(月=6)：發(fā)射超聲，輻照時(shí)間60秒，探頭頻率19MHz，TIS設(shè)置為O8，輸出聲強(qiáng)IsATA為800mW／cm2。D組(“=6)：添加全氟顯(劑量同B組)，并發(fā)射超聲(輻照條件同c組)。3觀察指標(biāo)熒光顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)染色陽(yáng)性細(xì)