相變納米超聲造影劑增效HIFU治療作用的研究.pdf

1、第一部分脂質(zhì)包裹的相變型液態(tài)氟碳納米粒造影劑的制備及相變研究
　　目的：選用脂質(zhì)作為殼材，液態(tài)氟碳PFH為內(nèi)核，制備脂質(zhì)包裹的相變型液態(tài)氟碳納米粒(Phase-change type perfluorocarbon nanoparticles，Pct-PFCNP)乳液造影劑，檢測其基本特性，并通過體外實驗探討用各種手段促進其相變的可能性。
　　方法：本部分研究分兩節(jié)進行。在第一節(jié)中，采用雙步乳化法制備脂質(zhì)包裹的Pct-PFC

2、NP乳液，并對其進行外觀、粒徑、電位、濃度、穩(wěn)定性等性質(zhì)檢測，總結(jié)出最佳的制備條件。在第二節(jié)中，于體外分別用溫度升高、診斷超聲、低頻治療超聲、高強度聚焦超聲激發(fā)，用超聲檢查和光學(xué)顯微鏡來研究制備的Pct-PFCNP發(fā)生相變的情況，探討促發(fā)其發(fā)生相變的可行性，得到最有利于相變發(fā)生的條件。
　　結(jié)果：第一節(jié)中，采用雙步乳化法能制備出粒徑均一、分布均勻、性質(zhì)較穩(wěn)定的脂質(zhì)包裹的Pct-PFCNP乳液，以PFH和脂質(zhì)懸液比例為1:8，聲振時

3、間為90s制備的粒徑最小，性質(zhì)最穩(wěn)定。第二節(jié)中，當溫度升高超過70℃、低頻治療超聲或高強度聚焦超聲作用時，均能促進Pct-PFCNP發(fā)生相變產(chǎn)生微泡，并增強超聲造影顯影。用各種機械指數(shù)的診斷超聲激發(fā)后，均未見到Pct-PFCNP發(fā)生明顯相變。
　　結(jié)論：通過比較簡單的工藝就能制備出脂質(zhì)包裹的Pct-PFCNP乳液，溫度和較高聲壓的超聲激發(fā)都能促進該乳劑中納米粒發(fā)生相變產(chǎn)生微泡，此相變超聲造影劑在分子影像學(xué)中有廣闊的應(yīng)用前景。

4、>　　第二部分脂質(zhì)包裹相變型液態(tài)氟碳納米粒乳液增效HIFU治療作用的研究
　　目的：通過體內(nèi)外實驗分別研究自制的Pct-PFCNP乳液增強HIFU消融正常肝臟和兔肝VX2移植瘤的效果的可行性，初步探討其增效機制。
　　方法：本部分研究分兩節(jié)進行。在第一節(jié)中，先用HIFU以不同的功率消融離體牛肝，比較注射不同濃度的Pct-PFCNP的實驗組與分別注射脂質(zhì)懸液和PBS液的兩個對照組在灰度變化時間、面積、變化值和解剖壞死體積的差別

5、，考察Pct-PFCNP乳液的體外增效效果，初步篩選Pct-PFCNP進行增效研究使用的HIFU劑量范圍和Pct-PFCNP乳液濃度。然后用HIFU以不同的作用時間和功率消融正常兔肝臟，比較注射Pct-PFCNP的實驗組與注射等量PBS液的空白對照組治療效果的差別，考察Pct-PFCNP體內(nèi)增強HIFU消融的效果，篩選較適宜Pct-PFCNP乳液體內(nèi)增效研究的HIFU劑量。并設(shè)計實驗比較當日注射與提前24h，48h注射Pct-PFCNP

6、乳液的增效效果。在第二節(jié)中，選取制作成功的兔VX2肝癌移植瘤模型，以150W，5s的HIFU劑量消融腫瘤，比較注射Pct-PFCNP乳液的實驗組和注射PBS的空白對照組在灰度變化面積和范圍、靶區(qū)解剖壞死體積，非靶區(qū)腫瘤組織治療后超微結(jié)構(gòu)的變化、凋亡指數(shù)和PCNA表達的差別，考察Pct-PFCNP乳液用于增強HIFU治療腫瘤的效果。
　　結(jié)果：在第一節(jié)中，體外實驗，在不同HIFU功率下，Pct-PFCNP組與脂質(zhì)懸液組、PBS組之間

7、在灰度變化時間、面積、范圍和解剖壞死體積上有顯著差異(P<0.05)，而后兩組之間除在120W和150W功率下消融時間差異顯著(P<0.05)，其余各項數(shù)據(jù)均無顯著差異(P>0.05)。稀釋5倍和10倍的Pct-PFCNP乳液，其灰度變化時間、面積、范圍和解剖壞死體積與稀釋20倍、40倍乳液之間差異顯著(P<0.05)，而稀釋5倍和10倍的Pct-PFCNP乳液之間在各個參數(shù)上無顯著差異(P>0.05)，稀釋20倍和40倍乳液之間在各個

8、參數(shù)上差異顯著(P<0.05)。
　　體內(nèi)消融正常肝臟實驗中，在各個HIFU劑量下，Pct-PFCNP組與空白對照組間各個參數(shù)差異顯著(P<0.05)，隨著能量升高、時間增加，Pct-PFCNP組解剖壞死體積增大。150W，5s的HIFU劑量更適合用于兔肝臟HIFU消融的增效研究。提前48h注射與當日注射、提前24h注射組灰度變化和壞死體積差異顯著(P<0.05)，而后兩組間各個參數(shù)差異不顯著(P>0.05)。
　　在第二節(jié)

9、中，Pct-PFCNP組與空白對照組灰度變化面積、范圍和腫瘤解剖壞死體積差異顯著(P<0.05)。3d后，Pct-PFCNP組治療后超微結(jié)構(gòu)變化顯著，Pct-PFCNP組與對照組間非靶區(qū)的腫瘤組織的凋亡指數(shù)和PCNA表達率的差異顯著(P<0.05)。
　　結(jié)論：初步研究證實，自制的Pct-PFCNP乳劑能夠縮短HIFU消融時間，減小HIFU消融功率，增強HIFU對體內(nèi)外病灶的治療效果。其機制主要與HIFU作用使Pct-PFCNP相

10、變產(chǎn)生微氣泡，增加超聲空化作用、靶區(qū)能量沉積和升溫作用、增強聲化學(xué)作用促進非靶區(qū)病灶壞死有關(guān)。
　　第三部分葉酸受體靶向液態(tài)氟碳納米粒乳劑的制備及增效HIFU治療作用的研究
　　目的：制備葉酸受體靶向的Pct-PFCNP乳劑，研究其體外靶向腫瘤細胞的性能，并考察將其用于增效HIFU治療裸鼠皮下卵巢癌移植瘤的效果。
　　方法：本部分研究分兩節(jié)進行。第一節(jié)中，首先將偶聯(lián)葉酸的磷脂加入到殼膜磷脂混合物中，經(jīng)過三氯甲烷溶解、旋

11、轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜、重新水合后，按1:8的比例加入PFH，采用雙步乳化法制備出葉酸受體靶向的Pct-PFCNP乳劑。之后在在人卵巢癌SKOV3細胞上驗證該葉酸受體靶向性的Pct-PFCNP的靶向性能，并與不帶葉酸的非靶向Pct-PFCNP組和游離葉酸干預(yù)組比較。第二節(jié)中，首先采用皮下注射腫瘤細胞的辦法建立荷人卵巢癌的裸鼠模型，通過尾靜脈注射后，研究靶向性Pct-PFCNP乳劑用于增效HIFU治療腫瘤的效果，以注射非靶向的Pct-PFCNP為對照

12、組，比較HIFU消融后兩組間灰度變化值、面積、解剖壞死體積、超微結(jié)構(gòu)的差異。
　　結(jié)果：第一節(jié)中，成功制備出葉酸受體靶向性的Pct-PFCNP乳劑，光鏡觀察，靶向組的納米粒大量粘附和聚集在細胞周圍，部分納米粒進入細胞內(nèi)。熒光顯微鏡觀察，藍色光激發(fā)，見發(fā)綠色熒光的Pct-PFCNP大量圍繞在發(fā)橘紅色熒光的細胞周圍。而非靶向組和游離葉酸干預(yù)組均未見到明顯的Pct-PFCNP與細胞結(jié)合的趨勢。激光共聚焦顯微鏡觀察，靶向組也見到大量綠色熒

13、光的Pct-PFCNP粘附于紅色熒光的細胞。第二節(jié)中，在HIFU治療劑量為120W，5s時，所有靶向Pct-PFCNP組腫瘤內(nèi)都見到明顯的壞死，呈灰白色，與周圍被TTC染成紅色的未壞死組織分界清楚。而非靶向Pct-PFCNP組有3只未見到明顯的壞死。兩組間灰度變化面積、變化值和解剖壞死體積有顯著差異(P<0.05)。靶向Pct-PFCNP組HE染色壞死呈大片均質(zhì)壞死，其內(nèi)的島狀殘存細胞較少，超微結(jié)構(gòu)下壞死組織內(nèi)呈輪廓不清，核膜破裂等表現(xiàn)