載基因超聲微泡造影劑治療肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝纖維化是慢性肝病共有的病理改變，其本質(zhì)是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增多，而降解相對(duì)減少，兩者失去動(dòng)態(tài)平衡，致使過(guò)多的ECM沉積于肝內(nèi)，同時(shí)伴有肝實(shí)質(zhì)的廣泛破壞和再生，導(dǎo)致肝小葉和肝血管結(jié)構(gòu)的紊亂，最終可引起肝功能失代償、腹水、上消化道出血等一系列并發(fā)癥。肝纖維化在進(jìn)入肝硬化前尚可逆轉(zhuǎn)，因此人們十分重視肝纖維化的研究，特別是基礎(chǔ)研究已取得較大的進(jìn)展，已可從基因水平上認(rèn)識(shí)肝纖維化的治療。

2、目前，常用的一般方法是將足夠的治療性基因?qū)胧軗p的肝臟，使外源性基因得到表達(dá)調(diào)控，達(dá)到延緩和治愈肝纖維化的目的。 針對(duì)肝纖維化的形成機(jī)制，其基因治療途徑主要包括抑制HSC的活化、促進(jìn)ECM降解、抑制間質(zhì)炎癥反應(yīng)和促進(jìn)肝細(xì)胞增生。目前，主要是在肝臟受到慢性損傷刺激或發(fā)生纖維化后，針對(duì)肝纖維化發(fā)生的某些環(huán)節(jié)，即針對(duì)特定的細(xì)胞因子，在體細(xì)胞基因水平進(jìn)行調(diào)控，以達(dá)到阻止肝纖維化病理進(jìn)展的目的。肝纖維化基因治療針對(duì)的重要因子包括：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)

3、因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growthfactor，EGF）、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor，KGF）、肝再生增強(qiáng)因子（augmenter

4、of liver regeneration，ALR）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（inhibitors of MMP，TIMP）等。 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）可以作為肝纖維化基因治療的一種手段。HGF主要由間質(zhì)細(xì)胞衍生的多功能因子，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式作用于上皮源性的細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)并且對(duì)抗

5、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡。HGF能調(diào)節(jié)膠原纖維的合成和炎性反應(yīng)，在治療創(chuàng)傷愈合、防止組織纖維化中起著重要的作用。因此，它在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的地位也越來(lái)越受到重視。 盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)做了許多努力，外源基因?qū)肴梭w組織細(xì)胞的安全性和有效性尚難以令人滿意，這也成為基因治療應(yīng)用于臨床的主要障礙。目前主要有兩類基因載體系統(tǒng)：病毒載體和非病毒載體，病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等，非病毒載體包括質(zhì)粒DNA、脂質(zhì)體等。這兩類載體有其

6、各自的優(yōu)缺點(diǎn)；病毒載體在基因轉(zhuǎn)染效率方面有很大優(yōu)勢(shì)，但載體本身的安全性限制了其廣泛應(yīng)用；非病毒載體毒性小、無(wú)免疫原性，制劑可高度濃縮，但其基因轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于病毒載體，且缺乏靶向性。 為了尋找一種更安全、高效的基因轉(zhuǎn)染方法，我們將超聲微泡造影劑作為載體。超聲微泡造影劑（以下簡(jiǎn)稱微泡）是由類似紅細(xì)胞大小的含氣微泡組成，注入靜脈后能到達(dá)紅細(xì)胞所能到達(dá)的部位，使血流豐富的實(shí)質(zhì)器官如心肌、肝臟、腎臟等在二維超聲儀檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生較強(qiáng)對(duì)比顯影。

7、新近研究發(fā)現(xiàn)，超聲靶向破壞微泡（ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）是增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的方式之一。微泡不但可以作為基因轉(zhuǎn)染的遠(yuǎn)程靶向促進(jìn)劑，在基因傳輸過(guò)程中保護(hù)基因；而且超聲靶向破壞微泡（UTMD）產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)可使細(xì)胞膜通透性增加，并致直徑≤7μm的微血管破裂，內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬，靶基因可通過(guò)破裂的微血管和內(nèi)皮細(xì)胞間隙到達(dá)組織細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)微泡破裂產(chǎn)生的沖擊波、射流作為一

8、種驅(qū)動(dòng)力量，可促使從微泡上釋放出來(lái)的基因進(jìn)入靶細(xì)胞達(dá)到靶向提高基因轉(zhuǎn)染效率目的。因此，超聲靶向破壞微泡（UTMD）具有安全無(wú)創(chuàng)、低免疫原性、可反復(fù)應(yīng)用以及器官特異性和超聲可到達(dá)靶器官的廣泛適用性等諸多優(yōu)勢(shì)。 基于以上理論，本課題通過(guò)制備載HGF基因的超聲微泡造影劑，然后運(yùn)用超聲靶向破壞微泡（UTMD）介導(dǎo)HGF基因治療大鼠肝纖維化，觀察治療后HGF基因在組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況及治療效果，為肝纖維化基因治療提供一個(gè)新的途徑和手段，為

9、研究和評(píng)價(jià)超聲靶向破壞微泡（UTMD）介導(dǎo)的肝臟基因轉(zhuǎn)染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本課題研究主要包括以下三個(gè)部分的內(nèi)容： 第一部分載基因脂質(zhì)超聲微泡造影劑的制備。 目的：制備一種能高效載基因的脂質(zhì)超聲微泡造影劑，評(píng)價(jià)其物理性質(zhì)、載基因能力和體內(nèi)顯影能力。方法：采用層-層吸附（layer-by-layer，LbL）法將HGF基因和多聚賴氨酸（Polylysine，PLL）分層吸附在自制的脂質(zhì)超聲微泡造影劑上，檢測(cè)微泡的

10、形態(tài)、分布、濃度、粒徑、表面電位、載基因能力和體內(nèi)顯影能力。結(jié)果：載PLL、載（PLL+DNA）和載（PLL+DNA+PLL）的微泡與空白微泡相比，其形態(tài)、濃度、粒徑?jīng)]有顯著差異；而載（PLL+DNA+PLL+DNA）的微泡粒徑增大，與空白微泡相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），但其仍然滿足一般造影劑的要求；隨著微泡載PLL和基因的層數(shù)增加，其表面電位向正或負(fù)反轉(zhuǎn)；同時(shí)，隨著載基因微泡外殼吸附基因的層數(shù)增加，載基因量也隨之增加；體內(nèi)造

11、影實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，載（PLL+DNA+PLL+DNA）的微泡可增強(qiáng)兔肝實(shí)質(zhì)顯像，持續(xù)20 min以上。結(jié)論：自制的載基因及PLL脂質(zhì)超聲微泡造影劑制備方法簡(jiǎn)單、載基因的效率高，可作為攜帶基因等生物活性物質(zhì)的載體材料。 第二部分超聲輻照微泡介導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因體外實(shí)驗(yàn)。 目的：研究超聲輻照超聲微泡造影劑促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）基因在大鼠肝星狀細(xì)胞株（hepatic stellate cell，HSC-T6）中的轉(zhuǎn)染效果

12、。方法：將HSC-T6接種在24孔板中，隨機(jī)分為以下5組：（1）空白對(duì)照組；（2）單純質(zhì)粒組；（3）載基因超聲微泡造影劑組；（4）質(zhì)粒+超聲組；（5）載基因超聲微泡造影劑+超聲組。轉(zhuǎn)染24h后，熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)pIRES2-EGFP/HGF在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率；MTT法檢測(cè)該轉(zhuǎn)染方法對(duì)HSC-T6生長(zhǎng)活性的影響；Western Blot檢測(cè)HGF蛋白的表達(dá)。結(jié)果：載基因超聲微泡造影劑十超聲組的綠色熒光強(qiáng)度及轉(zhuǎn)染率均高于其它

13、各組，并對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，且HGF蛋白的表達(dá)均高于各組（P<0.05）。結(jié)論：超聲輻照超聲微泡造影劑可提高基因在體外培養(yǎng)HSC-T6的轉(zhuǎn)染效率，并對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，該方法為提高非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率提供一個(gè)新策略。 第三部分超聲輻照微泡介導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因治療大鼠肝纖維化。 目的：探討超聲輻照載肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）的超聲微泡造影劑治療大鼠肝纖維化的可行性。方法將40只Wistar大鼠建成肝纖維化模型后隨機(jī)分為

14、5組，即①超聲+載基因超聲微泡造影劑組（HGF+US/MB），②超聲+單純質(zhì)粒組（HGF+US），③質(zhì)粒+超聲微泡造影劑組（HGF+MB），④單純質(zhì)粒組（HGF），⑤單純模型組（MA）。經(jīng)股靜脈注入超聲微泡造影劑，同時(shí)超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀輻照肝區(qū)，輻照條件為300 KH，2W/c㎡，輻照10s，間隔10s，共20min。于超聲輻照后14d行磁共振彌散加權(quán)成像（diffusion weighted imaging，DWI）檢查；然后處死各組

15、大鼠，取肝組織進(jìn)行蘇木精/伊紅（hematoxylin/eosin，HE）染色，觀察肝纖維化恢復(fù)情況；病理切片行masson染色，免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)肝組織中Ⅰ型膠原的表達(dá)，倒置顯微鏡觀察膠原分布情況；Western Blot檢測(cè)HGF蛋白在大鼠肝臟中的表達(dá)。結(jié)果： HGF+US/MB組的表觀彌散系數(shù)（apparent diffusion coefficient，ADC）值明顯高于其他各

16、組；相反地，指數(shù)表觀彌散系數(shù)（exponential apparent diffusion coefficient，EADC）低于其他各組；病理切片HE染色，可見(jiàn)HGF+US/MB組匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生，但肝小葉結(jié)構(gòu)完整，其余各組纖維組織增生程度強(qiáng)于HGF+US/MB組，尤其在MA組，出現(xiàn)假小葉；masson染色結(jié)果與HE染色的結(jié)果一致；IHC結(jié)果顯示，Ⅰ型膠原被染成棕黃色，HGF+US/MB組明顯少于其他各組，半定量計(jì)數(shù)為（0.17