應用超聲造影評價肝纖維化的實驗與臨床研究.pdf

1、肝纖維化是肝臟彌漫性病變發(fā)展為肝硬化的中間過程和重要階段，是細胞外基質合成和降解不平衡的結果，HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN是細胞外基質的重要組成成分，檢測其血清學水平對肝纖維化診斷有參考價值。應用影像學方法無創(chuàng)性評價肝纖維化一直是研究的熱點，但肝纖維化各期、乃至早期肝硬化缺乏特異性影像學表現(xiàn)。許多學者應用Doppler超聲測量肝動脈、門靜脈、肝靜脈血流量或血流速度、阻力指數(shù)等評價肝纖維化或肝硬化，結果存在一定爭議。 有學者利用微泡

2、聲學造影劑能夠增強Doppler信號的特點，建立了診斷肝硬化的新方法，但對于肝纖維化階段的評價作用尚有爭議，另外應用Doppler的方法存在易出現(xiàn)偽像且后處理過程復雜等缺點。本研究通過對肝纖維化動物模型及肝纖維化患者應用第二代聲學造影劑Sono Vue在脈沖反相諧波模式下進行肝臟超聲造影，觀察造影劑到達肝動脈、門靜脈、肝靜脈時間及肝實質時間一強度曲線變化，探討超聲造影(contrast enhanced ultrasound，CEUS)

3、能否反映肝纖維化進展過程中微循環(huán)的變化，并評價血清學、Doppler超聲、CEUS對肝纖維化的診斷效能。 材料與方法： 1、動物實驗部分健康雄性Wistar大鼠70只，隨機選取其中的62只大鼠進行肝纖維化模型制作，造模方法：首次按4ml/kg劑量經皮下注射60％CCl4，以后每周兩次按2ml/kg劑量經皮下注射60％CCl4；另8只大鼠為對照組，每周兩次按2ml/kg經皮下注射生理鹽水，首次劑量為4ml/kg。分別于5周

4、、7周、9周、11周隨機從進行造模的大鼠中取10只，從對照組大鼠中取2只進行超聲造影檢查。 首先對大鼠肝臟進行二維超聲檢查，在同時顯示門靜脈與肝靜脈的切面切換至CEUS程序。按0.1ml/Kg劑量經尾靜脈團注微泡聲學造影劑SonoVue，造影劑注射即刻開始計時。結合逐幀回放模式回放動態(tài)圖像，記錄造影劑到達肝動脈時間(hepatic artery arrival time，HAAT)、造影劑到達門靜脈時間(portal vein

5、arrivaltime，PVAT)、造影劑到達肝靜脈時間(hepatic vein arrival time，HVAT)，即相應血管內造影劑開始出現(xiàn)的時間。計算造影劑到達肝動脈與到達肝靜脈間隔時間(HVAT-HAAT,VAT)、造影劑到達門靜脈與到達肝靜脈間隔時間(HVAT-PVAT, VVT)。進入TIC ANALYSIS程序，感興趣區(qū)置于圖像中場，獲得肝實質時間一強度曲線，記錄達峰時間、峰值強度、上升斜率、下降斜率。所有動物在超聲檢

6、查后心臟取血5ml，檢測肝纖維化血清學指標，包括HA、PCⅢ、C-Ⅳ和LN。切除肝組織以10％甲醛固定，石蠟包埋，進行HE染色、Masson染色、網狀纖維染色，光鏡下判定肝纖維化程度。Envision二步法進行C-Ⅳ、LN免疫組化染色。切除肝組織以2.5％戊二醛固定，常規(guī)制作電鏡切片，透射電鏡觀察肝組織的超微結構。 統(tǒng)計學分析以病理肝纖維化分期為依據進行分組，不同肝纖維化分期血清學指標、免疫組化結果、CEUS結果的比較采用單因素

7、方差分析。血清學指標與免疫組化結果進行直線相關分析。CEUS結果與血清學指標、免疫組化結果進行直線相關分析。P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。 2、臨床研究部分收集我院經肝組織穿刺活檢確診的慢性病毒性肝炎患者32例，其中男18例，女14例，年齡18-64歲，平均36.9歲。其中無纖維化組(S0期)7例，輕度肝纖維化組(S1期/S2期)11例，中度肝纖維化組(S3期)6例，重度肝纖維化組(S4期)8例，對照組6例，平均33.5歲。

8、 檢測肝纖維化血清學直接指標：HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN。計算肝纖維化血清學間接指標APRI、Forns指數(shù)。 Doppler超聲測量肝動脈峰值血流速度(hepatic artery peak velocity，HAP)及阻力指數(shù)(hepatic artery resistive index，HARI)；門靜脈直徑(portal vein diameter，PVD)、門靜脈峰值血流速度(portal vein peak v

9、elocity，PVP)；計算肝動脈/門靜脈血流速度比值(HAP/PVP)。測量脾臟長徑(spleen length，SPL)。 CEUS檢查：受檢者仰臥位，在基波狀態(tài)下于右肋間斜切面使門靜脈及肝中靜脈顯示在同一切面上，切換至超聲造影程序，按0.03ml/Kg劑量經肘靜脈團注造影劑SonoVue，從注射造影劑即刻開始計時。結合逐幀回放模式回放動態(tài)圖像，記錄HAAT、PVAT、HVAT，計算VAT、VVT。進入TIC ANALYS

10、IS程序，感興趣區(qū)置于圖像中場，獲得肝實質時間-強度曲線，記錄達峰時間、峰值強度、上升斜率、下降斜率。統(tǒng)計學分析：不同組間各指標比較采用單因素方差分析。各指標與肝纖維化程度進行Spearman等級相關分析。對于組間比較差異有統(tǒng)計學意義的指標，分別以S＞1，S=4為判定肝纖維化和早期肝硬化的標準，應用ROC分析法評價其診斷肝纖維化的價值。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。 結果： 1、動物實驗部分 對照組8只大鼠全部

11、存活，光鏡下肝小葉結構正常，無變性、壞死，無纖維間隔形成。進行造模的大鼠于給藥4周后陸續(xù)開始出現(xiàn)死亡，按病理肝纖維化分期：S0期3只， S1期9只， S2期8只， S3期9只， S4期11只。隨著造模時間的延長，肝細胞變性、壞死，逐漸形成纖維間隔，肝小葉結構紊亂，最終形成假小葉。電鏡下見內皮細胞失窗孔，內皮下基底膜形成，同時內皮細胞周圍出現(xiàn)大量膠原纖維。隨著肝纖維化加重，C-Ⅳ、LN免疫組化染色陽性反應面積百分比增加，血清HA、PCⅢ、

12、C-Ⅳ、LN水平隨肝纖維化加重呈上升趨勢。血清學HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN水平與C-Ⅳ、LN免疫組化表達呈正相關。 對照組、S1期-S4期HAAT、PVAT兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義；S3期、S4期HVAT、VAT、VVT較對照組、S1期、S2期縮短。肝實質時間-強度曲線分析：S3期、S4期峰值強度及下降斜率較對照組、S1期、S2期降低。 HVAT與血清學指標HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN呈負相關，VAT、VVT與血清學指標H

13、A、PCⅢ、LN呈負相關。肝實質時間-強度曲線峰值強度及下降斜率與血清學指標HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN呈負相關。 HVAT、VAT、VVT與C-Ⅳ、LN免疫組化染色陽性反應面積百分比呈負相關。肝實質時間．強度曲線峰值強度、下降斜率與C-Ⅳ、LN免疫組化染色陽性反應面積百分比呈負相關。 2、臨床研究部分 肝纖維化血清學直接指標HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN及間接指標APRI、Foms指數(shù)與肝纖維化程度呈正相關。ROC分

14、析表明HA、PCⅢ、LN診斷早期肝硬化(S=4)的AUC為0.733～0.800(P<0.05)，APRI、Fores指數(shù)診斷早期肝硬化的AUC分別為0.765(P<0.05)、0.900(P<0.05)。 各組PVD、PVP、HAP、HAP/PVP、HARI、SPL比較差異無統(tǒng)計學意義。 HVAT、VAT、VVT與肝纖維化程度呈負相關，中度及重度肝纖維化組HVAT、VAT、VVT縮短， ROC分析表明HVAT、VAT、

15、VVT診斷早期肝硬化(S=4)的AUC為0.829～0.835(P<0.05)。肝實質時間一強度曲線達峰時間與肝纖維化程度呈正相關，峰值強度、上升斜率、下降斜率與肝纖維化程度呈負相關，中度及重度肝纖維化組峰值強度、下降斜率減低，重度肝纖維化組達峰時間延后，上升斜率減低。ROC分析表明上升斜率及下降斜率診斷早期肝硬化的AUC為0.731(P<0.05)及0.850(P<0.05)。 結論： 1、CEUS是安全的影像學檢查方

16、法，應用CEUS可以觀察肝動脈、門靜脈、肝靜脈顯影過程以及肝實質一時間強度曲線的變化特點，揭示肝纖維化血流動力學變化規(guī)律。 2、CEUS在臨床研究與動物實驗中的結果具有一致性，肝纖維化S3期、S4期HVAT、VAT、VVT縮短，肝實質時間一強度曲線峰值強度、下降斜率減低等變化與肝竇毛細血管化及肝臟動脈血化、肝內分流形成等肝內血流動力學改變有關。 3、CEUS指標有助于評價中、重度肝纖維化。CEUS缺乏早期診斷肝纖維化(S