超聲微泡造影劑介導(dǎo)EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脈絡(luò)膜新生血管(CNV)是很多眼底疾病的共同病理過程，大多病例會(huì)轉(zhuǎn)化為不可逆的盲，是視力預(yù)后極差的象征。雖然對它的治療手段繁多，但存在復(fù)雜、昂貴，療效欠確切等缺點(diǎn)。因此CNV的防治具有極大的意義。目前基因治療尚處于研究階段。微泡造影劑作為一種新型的基因載體，在聲像圖的監(jiān)控下進(jìn)行超聲輻照，微泡能夠在指定部位“爆破”，釋放所攜帶的基因。本文通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探討氬綠激光創(chuàng)建Long-Evans大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型的可行性，并研究超聲微泡造影劑

2、攜帶EGFP基因?qū)Υ笫笠暰W(wǎng)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效率及尋找有效的注射途徑。全文分為三個(gè)部分，依次對大鼠脈絡(luò)膜新生血管的形成，以微泡為基因載體與其他轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率對比，將基因載體以不同途徑引入體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率對比作了研究。 第一部分，實(shí)驗(yàn)性大鼠CVN模型研究。通過對雌性Long-Evans大鼠30只(60只眼，每只大鼠一眼為實(shí)驗(yàn)眼，另眼為對照眼)，以波長514.5nm的氬綠激光(光斑直徑50 μm，功率0.8W，時(shí)間0.05s)，在距視盤

3、2個(gè)視盤直徑處圍繞視乳頭進(jìn)行光凝，來建立CNV模型。分別于光凝后3，7，14，21，28天進(jìn)行眼底熒光造影。檢查后處死動(dòng)物(6只/次)，摘除眼球取眼后段組織制作石蠟切片，常規(guī)HE染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn):光凝后7天出現(xiàn)CNV，21天CNV大量形成，大鼠CNV發(fā)生率高(77.08％)；眼底造影、光鏡下均有相應(yīng)改變，F(xiàn)FA表現(xiàn)為視網(wǎng)膜血管無關(guān)的熒光素滲漏，光鏡下可見到CNV結(jié)構(gòu)。氬綠激光誘導(dǎo)Long-Evans大鼠CNV具有實(shí)驗(yàn)方法簡便易行，成模時(shí)間

4、短，維持時(shí)間長，成模率高，病理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點(diǎn)。 第二部分，將微泡攜帶基因的轉(zhuǎn)染效率與其他的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行了對比。雌性Long-Evans大鼠30只(60只眼)分為6組，以不同的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行EGFP基因的轉(zhuǎn)染：①單純超聲照射組；②微泡+超聲照射組；③裸質(zhì)粒組；④質(zhì)粒+超聲照射組；⑤質(zhì)粒+微泡；⑥質(zhì)粒+微泡+超聲照射組。兩周后處死大鼠，做石蠟切片HE染色觀察視網(wǎng)膜損傷情況，做冰凍切片在激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況及分析EGFP質(zhì)

5、粒在大鼠色素上皮層的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示：第①、②組大鼠視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，與正常大鼠組織結(jié)構(gòu)無明顯差異。EGFP在各組大鼠的視網(wǎng)膜包括色素上皮細(xì)胞層均有表達(dá)，第③、④、⑤組熒光強(qiáng)度較弱，第⑥組大鼠的視網(wǎng)膜熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。 第三部分，通過不同途徑將攜帶EGFP質(zhì)粒的超聲微泡造影劑引入體內(nèi)，比較兩種注射方式的基因轉(zhuǎn)染效率。雌性Long-Evans大鼠10只(20只眼)分為2組，以不同的注射方式將攜帶EGFP質(zhì)粒的超聲

6、微泡造影劑引入體內(nèi)：①尾靜脈注射組；②球周注射組。兩周后處死大鼠做冰凍切片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況及分析EGFP質(zhì)粒在大鼠色素上皮層的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示：EGFP在兩組大鼠的視網(wǎng)膜包括色素上皮細(xì)胞層均有表達(dá)，且熒光強(qiáng)度均較強(qiáng)。 本文實(shí)驗(yàn)創(chuàng)建Long-Evans大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型的可行性，并研究超聲微泡造影劑攜帶EGFP基因?qū)Υ笫笠暰W(wǎng)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效率及尋找有效的注射途徑。然而，CNV的基因治療尚處于起步階段，真正