超聲介導微泡造影劑對細胞和微血管以及基因在HUVEC內(nèi)轉染率的影響的研究.pdf

1、本研究旨在：通過觀察超聲介導MBCA對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的作用，靜脈注射USMBCA對大鼠心肌組織毛細血管及肌纖維的作用，以及使用超聲介導MBCA對綠色熒光蛋白報告基因(EPGFP)對HUVEC的轉染效率的影響，探討USMBCA是否可以作為基因治療的一種安全、有效的載體及其機理，應用超聲介導MBCA對HUVEC作用各種相關的適宜參數(shù)。 材料與方法：1.培養(yǎng)細胞。配制MBCA-聲諾維(SonoVue)。

2、 2.應用MTT比色實驗測定不同濃度MBCA對HUVEC活性的影響本實驗分組如下：根據(jù)添加MBCA的濃度不同，分為A組：MBCASonoVue濃度為50mg/ml，每孔加50μl；B組：MBCASonoVue濃度為25mg/ml；每孔加50μl；C組：MBCASonoVue濃度為17mg/ml，每孔加50μl；D組：MBCASonoVue濃度為12.5mg/ml，每孔加50μl；E組：對照組，每孔加生理鹽水50μl；F組：空白對照組，

3、不加細胞及MBCA，每孔加入200μl培養(yǎng)液。以上六組每組重復8孔。0.25％胰酶消化HUVEC單層培養(yǎng)細胞，用含10％FBS的1640培養(yǎng)液配成細胞懸液，以每孔含104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積150μl。如上所述，每組加入不同濃度的MBCA。進行超聲輻照后，培養(yǎng)細胞20小時，然后每孔加入MTT溶液10μl，37℃繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每空加入二甲基亞楓(DMSO)150μl，振蕩10分鐘。選49

4、0nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。整個實驗重復三次。MTT測細胞活性，加入0.9％Nacl組的細胞存活率為100％，每組各孔細胞的存活率為：每組各孔細胞的吸光值與加入0.9％Nacl組各孔細胞的吸光值的比值的百分比。 3.不同濃度MBCA對HUVEC凋亡及活性的影響用含10％FBS的1640培養(yǎng)液配成HUVEC懸液，計數(shù)細胞數(shù)將濃度調(diào)至1×106/ml，將1ml細胞懸液接種到直徑35mm單孔聚乙烯培養(yǎng)皿中

5、。根據(jù)添加MBCA的濃度不同，分為A組：MBCASonoVue濃度為50mg/ml；B組：MBCASonoVue濃度為25mg/ml；C組：MBCASonoVue濃度約17mg/ml；D組：MBCASonoVue濃度為12.5mg/ml。以上四組每孔加MBCASonoVue300μl。E組：對照組，每孔加生理鹽水300μl。以上五組每組重復6孔。超聲輻照后繼續(xù)培養(yǎng)細胞24小時。按照Annexin-v-FITC和PI雙標記細胞凋亡檢測試劑

6、盒說明操作，然后用熒光顯微鏡(FMS)觀察加入不同濃度MBCA，HUVEC凋亡和壞死細胞的情況，F(xiàn)MS下綠色細胞為早期凋亡細胞，紅色細胞為晚期凋亡和死亡細胞，用流式細胞儀(FCM)檢測每組細胞凋亡及存活率。 4.超聲介導MBCA對HUVEC細胞膜的作用實驗分組：A組：正常對照組；B組：單純超聲輻照組；C組：MBCA組，以上各組均為一皿；D組：MBCA+超聲輻照組，兩皿。用含10％FBS的1640培養(yǎng)液配成HUVEC懸液，計細胞數(shù)

7、將濃度調(diào)至1×106/ml，將1ml細胞懸液接種到直徑35mm單孔聚乙烯培養(yǎng)皿中。C組、D組各加濃度為17mg/ml的MBCASonoVue，每孔加300μl。B組、D組用超聲輻照，輻照后立即各組取一皿細胞送電鏡室進行掃描電鏡(SEMS)觀察。D組的另一皿細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時后進行SEMS觀察。 5.動物實驗實驗動物分組：將16只大鼠隨機分為4組，每組4只，A組：正常對照組；B組：超聲輻照組，C組：MBCA組；D組：MBCA+超

8、聲輻照組。用10％水合氯醛(1～2ml/kg)對大鼠行腹腔麻醉，之后胸部脫毛。C組、D組大鼠經(jīng)股靜脈輸入含氟碳氣體MBCA(0.5ml/每只)，注射時間約1分鐘，然后使用HP5500超聲診斷儀，S4探頭在B組、D組大鼠胸壁超聲輻照6分鐘，破壞心肌組織內(nèi)的MBCA。超聲輻照時采用contrast程序，間歇harmonic成像，探頭發(fā)射頻率為1.8MHz接收頻率為3.6MHz，機械指數(shù)1.6，聚焦深度4cm，采用心電觸發(fā)，每7個心動周期觸發(fā)

9、一次。其余設置取該程序默認值，保持儀器各項設置在整個實驗過程中不變。透射電鏡(TEMS)觀察：超聲輻照后。立即剪斷大鼠肋骨，取左心室前壁心肌，送電鏡室做TEMS觀察。 6.基因轉染實驗實驗分組：本實驗分組如下：A組：HUVEC；B組：HUVEC+EPGFP+Lipofectamine2000；C組：HUVEC+EPGFP+Lipofectamine2000+SonoVue微泡；D組：HUVEC+EPGFP+Lipofectami

10、ne2000+超聲輻照；E組：HUVEC+EPGFP+Lipofectamine2000+SonoVue微泡+超聲輻照。每組實驗重復5次。用不同條件的超聲輻照。輻照后立即將上述細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時，之后用FMS觀察EPGFP在HUVEC內(nèi)的表達，并且使用FCM測出EPGFP在HUVEC內(nèi)的轉染率。 結果：1.應用MTT比色實驗，不同濃度MBCA對HUVEC活性的影響不同。超聲介導初MBCA及其稀釋2倍時細胞存活率較低；初MBCA

11、稀釋3倍時細胞存活率增高，且較前兩者有明顯差異(P＜0.01)，初MBCA稀釋4倍與稀釋3倍時比較，對細胞存活率無顯著影響(P＞0.05)。 2.應用Annexin-v-FITC和PI雙標記細胞凋亡檢測試劑盒，檢測不同濃度MBCA對HUVEC活性、凋亡及壞死的影響不同。超聲介導初MBCA時存活細胞百分比較小，晚期凋亡和壞死細胞百分比較多；初MBCA稀釋2倍時存活細胞百分比增多，晚期凋亡和壞死細胞百分比減少，較前者有明顯差異(P＜

12、0.01)；初MBCA稀釋3倍時存活細胞百分比進一步增大，晚期凋亡和壞死細胞百分比進一步變小，且與初MBCA或其稀釋二倍時有明顯差異(P＜0.01)；初MBCA稀釋4倍與稀釋3倍時比較對細胞存活、晚期凋亡和壞死百分比無顯著影響(P＞0.05)。超聲介導初MBCA稀釋3倍時，早期凋亡細胞百分比明顯減小，且與初MBCA或其稀釋二倍時有明顯差異(P＜0.01)，初MBCA稀釋4倍時與初MBCA稀釋3倍時比較對早期凋亡細胞百分比無顯著影響(P＞

13、0.05)。 3.超聲介導MBCA可使大約23％HUVEC的細胞膜呈現(xiàn)直徑約2微米的小孔，該細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時后再進行SEMS觀察小孔關閉，細胞膜恢復正常。 4.TEMS觀察，超聲介導MBCA組，大鼠心肌組織毛細血管內(nèi)皮細胞膜破損、溶解，內(nèi)皮細胞線粒體空泡變性，細胞核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚；血管壁破裂，可見紅細胞外溢；心肌纖維斷裂、溶解。 5.EPGFP對HUVEC轉染24小時后，F(xiàn)MS下實驗組的HUVEC內(nèi)可見特異性

14、EPGFP表達，超聲+微泡組EPGFP表達量明顯增多。流式細胞儀分析結果顯示，超聲破壞MBCA能明顯提高脂質(zhì)體介導的EPGFP對HUVEC的轉染率。 結論：1.超聲破壞MBCA能明顯提高脂質(zhì)體介導的EPGFP對HUVEC的轉染率。USMBCA可作為基因治療的載體。 2.SonoVue可增強超聲的空化效應，使HUVEC膜上出現(xiàn)可逆性小孔，導致細胞膜通透性增強。空化效應是超聲介導MBCA增強基因轉染率主要機制之一。