靶向納米脂質(zhì)超聲造影劑評(píng)價(jià)肝臟儲(chǔ)備功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝臟是人體新陳代謝的重要器官。目前,肝臟疾病嚴(yán)重危害著人們的健康。肝臟具有很大的代償能力,早期肝損傷臨床表現(xiàn)常不明顯。但是,一旦肝臟功能損害嚴(yán)重時(shí)常常危及人們的生命。因此,尋求一種能無創(chuàng)監(jiān)測(cè)肝臟功能的醫(yī)學(xué)手段迫在眉睫。
　　 ASGPR是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜上的特異性受體,其能與末端帶半乳糖基的物質(zhì)發(fā)生受體-配體反應(yīng),且ASGPR的表達(dá)量與肝臟功能密切相關(guān),研究表明,當(dāng)肝臟功能下降時(shí),ASGPR的含量也相應(yīng)的減少。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用其這一特

2、性,對(duì)ASGPR介導(dǎo)的載基因或藥物進(jìn)行了重點(diǎn)研究,取得了巨大的進(jìn)展。近年來,隨著醫(yī)學(xué)分子影像學(xué)的飛速發(fā)展,影像學(xué)專家也積極的寄希望于利用影像學(xué)技術(shù)及ASGPR的這一特性,對(duì)肝臟功能的儲(chǔ)備進(jìn)行評(píng)估,這不僅對(duì)罹患肝臟疾病擬行手術(shù)的患者風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)有重要意義,且對(duì)術(shù)后病人的恢復(fù)情況也能及時(shí)、便捷的掌握。隨著超聲造影劑的不斷發(fā)展和超聲分子成像的不斷推進(jìn),我們期望能通過制備肝靶向性超聲造影劑,利用超聲特有的無創(chuàng)性這一優(yōu)勢(shì),對(duì)肝臟儲(chǔ)備功能進(jìn)行在體實(shí)時(shí)的

3、監(jiān)測(cè)。以往超聲對(duì)于肝功能的檢測(cè)方面,常用的包括利用超聲造影來評(píng)價(jià)肝臟血流的區(qū)域灌注,用多普勒技術(shù)檢測(cè)超聲促發(fā)造影劑使微泡破裂后血管內(nèi)的動(dòng)力學(xué)改變,研究了血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)與肝臟功能的關(guān)系。國(guó)外也有學(xué)者利用超聲多普勒技術(shù),分析肝靜脈與門靜脈的血流多普勒波形對(duì)肝臟功能進(jìn)行評(píng)估。而利用ASGPR受體所介導(dǎo)的肝靶向超聲顯像,國(guó)內(nèi)外研究甚少。
　　 因此,本課題主要從以下三個(gè)部分進(jìn)行了研究:
　　 第一部分中,我們首先制備了靶向肝細(xì)胞

4、膜受體ASGPR的配體一半乳糖化多聚賴氨酸,在此基礎(chǔ)上分別制備了靶向脂質(zhì)微泡超聲造影劑和液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑,驗(yàn)證了兩種靶向超聲造影劑的體外尋靶能力。
　　 第二部分中,我們研究自制靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑在正常大鼠肝臟靶向性聚集超聲顯影特性,同時(shí),建立不同程度的大鼠肝損傷模型,利用靶向超聲分子顯像對(duì)比分析各級(jí)別大鼠急性肝損傷后峰值回聲強(qiáng)度的改變與各級(jí)別大鼠急性肝損傷后ASGPR的含量及血清學(xué)檢查的關(guān)系。
　　

5、 第三部分中,為了進(jìn)一步探索該靶向納米脂質(zhì)超聲造影劑在肝腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用,我們研究了普通脂質(zhì)微泡超聲造影劑與自制靶向納米脂質(zhì)超聲造影劑在兔VX2腫瘤模型中的對(duì)比顯影特點(diǎn)。
　　 第一部分靶向脂質(zhì)超聲造影劑的制備及體外實(shí)驗(yàn)
　　 目的:(1)采用還原胺化法,人工合成去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的配體半乳糖化多聚賴氨酸(GaL-PLL);探討連接以半乳糖化多聚賴氨酸作為配體的脂質(zhì)微泡超聲造影劑與人肝癌細(xì)胞HepG2的靶

6、向結(jié)合能力。(2)探討制備出的肝靶向性液態(tài)氟碳納米超聲造影劑的一般特性、與人肝細(xì)胞L02的靶向結(jié)合及體外聚集顯像效果。
　　 方法:(1)用還原胺化法將多聚賴氨酸進(jìn)行半乳糖化,制備出去唾液酸糖蛋白受體的靶向配體-半乳糖化多聚賴氨酸。SDS-PAGE蛋白電泳鑒別半乳糖化多聚賴氨酸合成情況,計(jì)算出所連接的半乳糖與多聚賴氨酸的量的比例。用葡聚糖凝膠柱G-15分離純化并收集半乳糖化多聚賴氨酸。在室溫下與自制脂質(zhì)微泡發(fā)生化學(xué)結(jié)合制備成靶向

7、脂質(zhì)微泡,于熒光顯微鏡及激光共聚焦下觀察體外靶向效果。(2)利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及聲振法制備液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑;培養(yǎng)人肝細(xì)胞L02,于不同時(shí)間點(diǎn)觀察與L02細(xì)胞的靶向結(jié)合;飛利浦iU22超聲診斷儀L12-5探頭對(duì)比觀察靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑的體外顯像效果。
　　 結(jié)果:(1)半乳糖與多聚賴氨酸在摩爾比為1:100,室溫下反應(yīng)24h時(shí),能進(jìn)行高效連接。靶向脂質(zhì)微泡粒徑平均約為2.05μm,大小較均一;激光共聚焦見HepG2

8、肝癌細(xì)胞能與靶向造影劑特異性結(jié)合。(2)靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑粒徑極小,分布均勻,形態(tài)呈圓球形,且能與L02有效結(jié)合;體外乳膠囊顯示:脫氣水側(cè)呈現(xiàn)無回聲,靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑側(cè)呈現(xiàn)高回聲。
　　 結(jié)論:(1)連接有以半乳糖化多聚賴氨酸為靶向配體的脂質(zhì)微泡在HepG2肝癌細(xì)胞的內(nèi)吞作用下能與之有效結(jié)合。(2)以去唾液酸糖蛋白受體為靶向受體,自制的攜半乳糖化多聚賴氨酸的靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑能有效與人肝細(xì)胞

9、L02靶向結(jié)合,該靶向超聲造影劑能在體外聚集顯影。該靶向超聲造影劑粒徑極小,是細(xì)胞水平上肝靶向性超聲分子顯像的一種理想的超聲分子探針。
　　 第二部分靶向超聲造影評(píng)價(jià)大鼠不同程度肝損傷后的肝臟儲(chǔ)備功能
　　 目的:(1)研究自制靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑在正常大鼠肝臟靶向性聚集超聲顯影特性,為超聲分子成像定量評(píng)價(jià)肝臟功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。(2)靶向超聲分子顯像對(duì)比分析各級(jí)別大鼠急性肝損傷后峰值回聲強(qiáng)度的改變與各級(jí)別大鼠急

10、性肝損傷后ASGPR的含量及血清學(xué)檢查的關(guān)系。
　　 方法:(1)建立大鼠肝功能檢測(cè)指標(biāo)(總蛋白、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶)的標(biāo)準(zhǔn)。健康雄性SD大鼠10只,抽血前一天禁飼,10ml空針分別抽取下腔靜脈血2ml置于離心管中,標(biāo)記并置于4℃冰箱過夜,待其血清成分自然析出后送檢。
　　 健康雄性SD大鼠10只,經(jīng)尾靜脈團(tuán)注靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑,注射開始至0.5h內(nèi)連續(xù)觀察并記錄;0.5h至1h內(nèi)每10min觀察

11、并記錄;1h至造影劑消退每30min觀察并記錄肝實(shí)質(zhì)超聲圖像。DFY型超聲圖像定量分析診斷儀對(duì)各時(shí)間點(diǎn)采集到的超聲圖像進(jìn)行分析。
　　 (2)25只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組,根據(jù)腹腔灌注四氯化碳(CCl4)分析純的劑量不同,用食用植物油分別配制濃度為10％、20%、30%、40%及50%的CCl4溶液,每組對(duì)應(yīng)注射1ml的配制溶液,1d后10ml空針分別抽取下腔靜脈血2ml置于離心管中,標(biāo)記并置于4℃冰箱過夜,待其血清成分自

12、然析出后送檢總蛋白、白蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶及谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量。確定注射劑量后,按相同的方法建模20只,每組4只,1d后取肝組織分別檢測(cè)各組中ASGPR的含量,并取肝組織進(jìn)行掃描電鏡觀察肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞間隙即“窗孔”的改變,TUNEL法檢測(cè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況。
　　 健康雄性SD大鼠25只,隨機(jī)分成5組,每組5只,按前述方法建立不同級(jí)別的急性大鼠肝損傷模型,實(shí)驗(yàn)時(shí)常規(guī)麻醉,胸腹部備皮,經(jīng)尾靜脈團(tuán)注靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑,注射開

13、始至0.5h內(nèi)連續(xù)觀察并記錄;0.5h至1h內(nèi)每10min觀察并記錄;1h至造影劑消退每30min觀察并記錄肝實(shí)質(zhì)超聲圖像。DFY型超聲圖像定量分析診斷儀對(duì)各時(shí)間點(diǎn)采集到的超聲圖像進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:(1)正常大鼠血清總蛋白含量為60.0～80.0g/L,白蛋白含量為30.0～50.0g/L,谷草轉(zhuǎn)氨酶含量為0～200U/L,谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量為0～50 U/L,自制靶向液態(tài)氟碳納米超聲造影劑在正常大鼠肝實(shí)質(zhì)的達(dá)峰時(shí)間為61.2

14、0±4.83min,峰值回聲強(qiáng)度為88.20±0.08dB,靶向造影劑消退較緩慢,清除時(shí)間為310.00±17.80min。(2)電鏡觀察到急性肝損傷后肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞間隙增大;TUNEL染色發(fā)現(xiàn),隨著對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠注射CCl4的濃度的增加,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡率增加,各組兩兩對(duì)照,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;隨著肝損傷程度的增加,肝組織內(nèi)的ASGPR含量逐漸減少,且各組樣本均數(shù)兩兩比較行方差分析,各組樣本均數(shù)差異均P＜0.05;隨著肝損傷程度的增加,肝

15、靶向超聲造影后峰值回聲強(qiáng)度逐漸降低,除正常對(duì)照組與10%濃度CCl4組P＞0.05外,其余各組兩兩比較均P＜0.05,而達(dá)峰時(shí)間、清退時(shí)間、造影前肝實(shí)質(zhì)回聲強(qiáng)度、清退后肝實(shí)質(zhì)回聲強(qiáng)度均P＞0.05;血清學(xué)檢查各組總蛋白和白蛋白含量無明顯變化,谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶隨著肝損傷程度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。
　　 結(jié)論:自制的靶向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜受體ASGPR的液態(tài)氟碳納米超聲造影劑的肝靶向性顯影效果佳;不同程度肝損傷后的靶向超聲顯

16、影結(jié)果改變與ASGPR結(jié)果改變一致,有利于超聲顯影定量評(píng)價(jià)肝臟功能。
　　 第三部分自制靶向脂質(zhì)超聲造影劑與普通脂質(zhì)微泡超聲顯影的對(duì)比實(shí)驗(yàn)
　　 目的:探討自制的靶向脂質(zhì)微泡超聲造影劑在正常兔肝臟與VX2兔腫瘤模型的超聲成像特點(diǎn),對(duì)比研究其與普通脂質(zhì)微泡超聲造影劑超聲成像的異同。
　　 方法:制備靶向脂質(zhì)微泡超聲造影劑與普通脂質(zhì)微泡超聲造影劑,分別從正常兔及VX2腫瘤兔耳緣靜脈團(tuán)注,使用飛利浦iU22超聲診斷儀的

17、造影模式,實(shí)時(shí)監(jiān)控兩種不同造影劑各自的超聲顯影特點(diǎn),DFY超聲圖像定量分析診斷儀分析圖像的達(dá)峰時(shí)間、峰值回聲強(qiáng)度、清除時(shí)間并對(duì)各組參數(shù)進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:在正常兔肝實(shí)質(zhì),普通脂質(zhì)微泡超聲造影劑(MB)達(dá)峰時(shí)間明顯早于自制的靶向脂質(zhì)微泡超聲造影劑(MB')達(dá)峰時(shí)間,峰值回聲強(qiáng)度前者高于后者,清除時(shí)間前者顯著短于后者。在VX2腫瘤區(qū),MB達(dá)峰時(shí)間明顯早于MB',峰值回聲強(qiáng)度前者明顯高于后者,清除時(shí)間前者顯著短于后者。