靶向超聲造影劑無創(chuàng)評價組織缺血再灌注損傷的實驗研究.pdf

1、隨著新型超聲造影劑(UCA)的不斷出現(xiàn)和超聲造影新技術(shù)的飛速發(fā)展，明顯提高了超聲診斷心、肝、腎、腦等實質(zhì)性器官病變的敏感性和特異性，但大多數(shù)超聲造影劑無定向選擇性(即無靶向性)，因此很難對疾病進行特異性的定性及定位診斷。本研究首先制備出用于實驗的表面活性劑超聲造影劑(SPMB)，并初步觀察其理化性質(zhì)，急性動物毒性和顯像效果，在此基礎(chǔ)上進一步將其制備成對激活的中性粒細胞(PMN)具有靶向性的超聲造影劑，觀察其對腎臟和心肌缺血再灌注損傷的顯

2、像效果并分析與髓過氧化物酶(MPO)的相關(guān)性，并且在體外細胞水平分析其靶向性作用的可能機制。 表面活性劑超聲造影劑的制備、安全性及顯像效果的實驗研究 (一)表面活性劑超聲造影劑的制備及其急性毒性動物實驗 以司盤60(Span60)和吐溫80(Tween80)為原材料，經(jīng)高溫加熱熔融，冷卻變性后，最后在聲振同時緩慢充入八氟丙烷(C3F8)氣體，制備成SPMB微泡，激光粒度散射儀測量微泡的粒徑分布，血球計數(shù)儀計算微泡

3、的濃度，光鏡下觀察微泡的形態(tài)，并觀察隨時間的延長微泡粒徑、濃度及形態(tài)的變化。以62只清潔級小白鼠為實驗對象，按Bliss法分析SPMB的LD50值。并觀察實驗動物的大體解剖改變和鏡下組織學改變。結(jié)果：光鏡下可見制備成功的SPMB呈圓球型，中空狀，散在分布，大小均勻一致，測得平均粒徑為2．56±1．20μm，濃度為(7．2±O．8)×109/mL。隨時間延長SPMB的粒徑逐漸增大，濃度逐漸降低，形態(tài)未見明顯改變。急性毒性實驗測得LD50值

4、為4．Ol(3．67-4．58)mL/kg。大體標本可見，心臟充血嚴重，肺臟膨脹，表面有出血點，肝臟、腎臟未見明顯改變。組織學觀察可見，心肌血管擴張充血，間質(zhì)內(nèi)有少許紅細胞，心肌部分橫紋肌斷裂；肺泡壁間毛細血管內(nèi)見大量紅細胞，部分肺泡有破壞；肝結(jié)構(gòu)基本正常；腎小球、腎小管基本正常。結(jié)論：聲振法可成功制備SPMB，該造影劑的穩(wěn)定性較好，毒性較弱，可以滿足實驗使用。 (二)表面活性劑超聲造影劑對犬正常心肌的顯像效果 用上述實

5、驗中制備的SPMB對七只開胸犬的正常心肌進行顯像觀察，將造影劑稀釋10、20、30倍，分別對心肌進行顯像，觀察其不同的顯像效果并對其進行定性和定量分析。結(jié)果：造影劑的劑量在稀釋10倍至30倍之間時，均是在觸發(fā)間歇為l：8個心動周期時心肌顯像效果最佳，此時造影劑在心肌組織內(nèi)達到飽和狀態(tài)。隨著稀釋倍數(shù)的增加，心肌顯像的視覺效果越弱，后方的聲影也越弱，前壁、后壁心肌和心腔內(nèi)回聲強度也明顯降低，三組之間相互比較，差異有非常顯著性意義(P<0．0

6、1)，只有側(cè)壁心肌沒有明顯改變(P>O．05)。當造影劑稀釋20倍時，心肌顯像視覺效果較明顯，后方聲影不是很強烈，前壁、后壁心肌和心腔內(nèi)回聲強度沒有明顯減低。結(jié)論：SPMB成功實現(xiàn)了對正常心肌組織的顯像，本研究還發(fā)現(xiàn)其稀釋20倍時的濃度對心肌組織顯像的效果較理想，最利于觀察心肌血流灌注情況。 二、靶向超聲造影劑評價組織缺血再灌注損傷及作用機制的實驗研究 (一)靶向超聲造影劑評價兔腎臟缺血再灌注損傷的實驗研究 將S

7、PMB表面結(jié)合上磷脂酰絲氨酸(PS)，制備成對激活的中性粒細胞(PMN)具有靶向性的造影劑(SPMB-PS)，流式細胞術(shù)(FCM)檢測PS位于微泡的表面，比較SPMB-PS與SPMB的形態(tài)及大小。12只新西蘭大白兔，隨機分為2組，靶向組(SPMB-PS)和非靶向組(SPMB)，在腎臟缺血一再灌注(I-R)損傷模型建立前后進行顯像，然后擬合出造影顯像的時間-強度曲線(TIC)。另取6只新西蘭大白兔建立腎臟I-R損傷模型，用SPMB-PS對

8、I-R腎臟進行顯像15min后，立即取組織塊進行髓過氧化物酶(MP0)活性測定并進行免疫組織化學分析。最后分析I-R腎臟造影后15min的回聲強度與MPO的關(guān)系。結(jié)果：SPMB-PS與SPMB的形態(tài)及大小基本一致。FCM檢測發(fā)現(xiàn)，SPMB-PS被AnnexinV-FITC標記后，熒光曲線明顯右移，證明了PS結(jié)合在SPMB的表面。從腎臟造影顯像的TIC曲線可見，SPMB-PS與SPMB對正常腎臟顯像時，其達峰時間和排空時間基本一致，造影后

9、15min基本排空。對I-R腎臟顯像時，其達峰時間一致，但SPMB-PS的排空時間與SPMB比較明顯延遲。SPMB-PS與SPMB對正常腎臟造影后15min的回聲強度無差異(P>O．05)，而對I-R腎臟造影后15min的回聲強度的差異有非常顯著性意義(P

10、SPMB-PS在對I-R。腎臟顯像時出現(xiàn)延遲排空現(xiàn)象，對激活的PMN具有靶向性，可以無創(chuàng)評價腎臟I-R損傷的嚴重程度。 (二)靶向超聲造影劑評價犬心肌缺血再灌注損傷的實驗研究 用SPMB-PS對9只犬心肌缺血再灌注(I-R)模型，采用延遲顯像的方式進行實時心臟超聲造影(MCE)。實驗結(jié)束后，在正常心肌和I-R心肌處取組織塊立即進行髓過氧化物酶(MPO)活性測定。分析I-R心肌部位回聲強度與MP0的相關(guān)性及其標化后二者的相

11、關(guān)性。結(jié)果：實時MCE顯像發(fā)現(xiàn)I-R心肌部位的造影劑回聲較正常部位的回聲明顯增強。定量分析也表明I-R損傷心肌聲像圖的回聲強度(22．56±4．62GS)明顯增高，與正常心肌(16．57±3．82GS)和缺血心肌(5．00±2．58GS)比較，差異均有顯著性意義(P

12、-R部位，這對于無創(chuàng)評價心肌I-R損傷的嚴重程度有很大的臨床價值。 (三)靶向超聲造影劑的作用機制研究 取2×107個AnnexinV-FITC標記的SPMB-PS與2×106個白細胞混合，流式細胞術(shù)(FCM)測定白細胞中的中性粒細胞(PMN)激活前后與SPMB-PS的結(jié)合情況，以及在補體和β2整合素中的Mac-1缺乏時激活的PMN與SPMB-PS的結(jié)合情況。結(jié)果：未激活的PMN與SPMB-PS的結(jié)合率為(5．27±O．