微血管損傷的靶向超聲造影劑制備及其黏附效能的實驗研究.pdf

1、目的：1.探討靶向超聲造影劑的構建方法及其構建過程對超聲造影劑微泡物理性質的影響，為構建靶向化超聲造影劑提供實驗方法學；2.建立葡萄糖損傷的血管內細胞模型，為驗證靶向微泡造影劑的黏附能力提供實驗平臺并為糖尿病血管病變早期診斷的進一步研究提供實驗基礎；3.應用平板流動腔技術檢測靶向超聲微泡對特異性靶細胞的黏附能力，為下一步應用靶向化微泡進行糖尿病早期微血管病變的特異性診斷提供可靠的實驗依據(jù)。
　　 方法：1.應用生物素-鏈霉親和素

2、連接系統(tǒng)，使注射用六氟化硫微泡(SonoVue)與特異性抗血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)抗體連接，用間接免疫熒光法檢測抗體與微泡的連接，用馬爾文激光粒徑分析儀分別測定生物素化處理前后微泡的粒徑，采用超聲診斷儀評價微泡靶向化構建前后的顯像效果。2.傳代培養(yǎng)人主動脈血管內皮細胞(HAEC)至3、4代，選取細胞生長良好的細胞備用，選取葡萄糖濃度為5.5mmol/1、7.7mmol/1、11.6mmol/1、17.7mmol/1、21.8

3、mmol/1、30mmol/1的細胞培養(yǎng)液分別干預細胞3h、6h、12h、24h，干預結束后應用FITC標記的鼠抗人VCAM-1抗體及鼠抗人TM抗體直接標記細胞膜表面抗原，流式細胞儀檢測細胞攜帶FITC抗體的細胞陽性率，進行統(tǒng)計學分析處理，篩選最佳葡糖糖干預濃度和時間。3.將3、4代HAEC種植于20mm的圓形蓋玻片上培養(yǎng)，待細胞生長融合達到90％以上時應用葡萄糖濃度為16.7mmol/1的培養(yǎng)液干預細胞6h，干預結束后將蓋玻片置于平行

4、板流動腔裝置內，連接通路，使平行板板流動腔內充滿微泡混懸液，細胞與混懸液充分結合，調節(jié)液體流速，觀察流速調節(jié)前后視野內的微泡數(shù)量，計算微泡的黏附率，進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：1.SonoVue與特異性抗體通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)成功連接，間接免疫熒光檢測呈陽性。生物素修飾后的微泡粒徑分布變窄，與普通微泡的超聲顯像效果略有差異。2.人主動脈血管內皮細胞膜表面VCAM-1的表達隨細胞培養(yǎng)液的葡萄糖濃度增高而增高，至16.7mm

5、ol/1時達峰值，之后隨葡萄糖濃度升高而降低；同時VCAM-1的表達隨葡萄糖作用時間延長而增高，至6h時達峰值，之后隨葡萄糖作用時間延長而降低。人主動脈血管內皮細胞TM的表達趨勢與VCAM-1相似，在葡萄糖濃度為16.7mmol/1、作用時間為3h時達峰值。3.經(jīng)葡萄糖損傷的細胞周圍黏附的靶向微泡數(shù)量多于普通微泡；正常細胞周圍黏附的兩種微泡均較少。普通微泡、靶向微泡與細胞的黏附率隨剪切力的增加而逐漸下降，靶向微泡在相同剪切力條件下黏附率

6、高于普通微泡，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：1.通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)可以成功構建靶向化超聲微泡，靶向化處理因素對微泡的粒徑有一定的影響，對微泡的超聲顯像效果略有影響。2.通過葡萄糖刺激入主動脈血管內皮細胞可成功構建血管內皮細胞的損傷模型，為糖尿病血管病變研究提供實驗基礎。3.平行板流動腔技術可以用于評價靶向微泡的特異性黏附能力，是一種理想的檢測微泡靶向化構建效果的工具；靶向微泡與靶細胞可以特異性結合且具有較強的黏附能力，