靶向微泡評(píng)價(jià)兔睪丸缺血-再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:檢測(cè)自制普通脂質(zhì)微泡和靶向脂質(zhì)微泡的物理學(xué)性質(zhì),評(píng)價(jià)靶向微泡在兔睪丸完全缺血/再灌注損傷中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:第一部分:制備普通脂質(zhì)微泡和靶向脂質(zhì)微泡將各種相關(guān)脂質(zhì)材料按一定比例溶解于適量蒸餾水中,交替使用60℃水浴和超聲波振蕩至分散完全,通六氟化硫(SF6)氣體,機(jī)械振蕩至形成乳白色液體即制備好普通脂質(zhì)微泡或生物素(biotin)化脂質(zhì)微泡。生物素化脂質(zhì)微泡經(jīng)靜置棄下清液純化后,按一定比例加入親和素(avidin),繼

2、續(xù)靜置棄下清液純化后,按一定比例加入生物素化的P選擇素抗體(Bio-P),冰箱4℃保存?zhèn)溆?。采用血?xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)量普通微泡和靶向微泡的粒徑及濃度。采用FITC標(biāo)記的二抗與攜抗P-選擇素抗體微泡結(jié)合,熒光顯微鏡下觀察抗P-選擇素抗體與微泡的連接情況。
　　第二部分:30只成年健康新西蘭大白兔隨機(jī)分成:對(duì)照組(假手術(shù)組/S組)、缺血/再灌注組(IR組,IR組又分為0.5h組、1h組、2h組、4h組),每組6只。S組隨機(jī)暴露一側(cè)精索,4h

3、后行MB和MBp的雙側(cè)睪丸造影。IR組隨機(jī)選擇一側(cè)睪丸進(jìn)行扭轉(zhuǎn)手術(shù),將術(shù)側(cè)睪丸血流完全阻斷4h后解除結(jié)扎,血流即刻出現(xiàn),分別再灌注0.5h、1h、2h、4h。IR組在術(shù)前和術(shù)后行MB和MBp的雙側(cè)睪丸造影。CEU采用經(jīng)耳緣靜脈彈丸式注射法進(jìn)行,每只實(shí)驗(yàn)兔注射(間隔20min)MB和MBp約0.2ml/Kg(MB、MBp濃度5.0×108個(gè)/mL),動(dòng)態(tài)觀察睪丸組織內(nèi)造影劑充盈情況,經(jīng)過(guò)5～10min循環(huán)時(shí)間待血池中循環(huán)微泡完全消失后,記

4、錄缺血再灌注睪丸及正常睪丸顯影圖像,全部聲學(xué)造影圖像存于機(jī)內(nèi),以備脫機(jī)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死實(shí)驗(yàn)兔,取術(shù)側(cè)睪丸,10％甲醛固定,行病理學(xué)檢查。采用專(zhuān)業(yè)超聲軟件分析造影圖像,評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)兔睪丸顯影的聲強(qiáng)度(Power,10E-5AU),當(dāng)血池內(nèi)循環(huán)微泡消退后的第一幀CEU圖像的POWER值代表微泡在睪丸組織的滯留濃度。使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均以`c±s表示,組間數(shù)據(jù)的兩兩比較采用單因素方差分析,差異性檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為p<0

5、.05。
　　結(jié)果:第一部分:普通脂質(zhì)微泡和靶向脂質(zhì)微泡均為乳白色懸濁液,光鏡下可見(jiàn)分布均勻的圓形微泡,粒徑分別約1.5～4.0mm(MB),1.0～3.0mm(MBp),濃度分別約5.0×108個(gè)/mL(MB),1.0×109個(gè)/mL(MBp)。熒光顯微鏡下觀察普通微泡無(wú)熒光,靶向微泡發(fā)明顯綠色熒光。
　　第二部分:MBp的第一幀CEU圖像顯示1h組、2h組術(shù)側(cè)睪丸可見(jiàn)顯著的超聲顯影,0.5h組、4h組術(shù)側(cè)睪丸可見(jiàn)輕度的超

6、聲顯影,而健側(cè)睪丸和S組雙側(cè)睪丸均無(wú)明顯的超聲顯影;MB的第一幀CEU圖像顯示IR組術(shù)側(cè)睪丸可見(jiàn)輕度的超聲顯影,Power值在0.5h組、1h組、2h組、4h組的術(shù)側(cè)睪丸,MB均小于MBp(p均<0.05),而MB的Power值在IR組術(shù)側(cè)睪丸和健側(cè)睪丸間也有顯著性差異(p<0.05),健側(cè)睪丸和S組雙側(cè)睪丸MB均無(wú)明顯的超聲顯影;MBp的Power值在IR組的術(shù)側(cè)睪丸較健側(cè)睪丸顯著增強(qiáng)(p<0.05);MB、MBp在術(shù)前各組的Powe

7、r值無(wú)顯著性差異(p>0.05)。睪丸病理檢查示對(duì)照組睪丸生精小管排列細(xì)胞形態(tài)正常,排列整齊,間質(zhì)無(wú)充血、水腫,IR組睪丸睪丸生精小管呈不同程度壞死,0.5h組局部間質(zhì)輕微充血,血管擴(kuò)張,1h組間質(zhì)血管進(jìn)一步擴(kuò)張,充血淤血加重,白細(xì)胞增多、貼壁,2h組間質(zhì)可見(jiàn)明顯充血及白細(xì)胞浸潤(rùn),4h組間質(zhì)進(jìn)一步充血水腫,白細(xì)胞游出,紅細(xì)胞漏出;免疫組化示實(shí)驗(yàn)組睪丸間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞見(jiàn)P-選擇素表達(dá),對(duì)照組血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)。
　　結(jié)論:1、我們