缺血預(yù)處理預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning,IP)是預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷最強(qiáng)有力的內(nèi)源性保護(hù)措施,但其確切機(jī)制仍不明了.迄今為止,國內(nèi)外有關(guān)IP的研究主要集中在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究,鑒于肝臟由多種細(xì)胞組成,又受神經(jīng)、體液調(diào)節(jié),干擾因素多,因此我們通過體外實(shí)驗(yàn)來觀察IP對肝臟的保護(hù)作用并探討其可能的機(jī)制.在該研究中,我們首先分離、培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞,建立IP預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷的體外模型,利用基因芯片技術(shù)篩選出與IP相關(guān)的基因,

2、并在蛋白質(zhì)水平上分析IP的可能作用機(jī)制.另外,我們還利用原代培養(yǎng)的大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(hepatic sinus endothelial cell,HSEC),研究其在IP預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷中的作用.第一部分:大鼠肝細(xì)胞和HSEC的分離、純化和培養(yǎng);目的:體外分離、培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞和HSEC.方法:采用Ⅳ型膠原酶灌注法分離大鼠肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,運(yùn)用Percoll梯度密度離心法分離和純化HSEC,并利用含肝細(xì)胞上清液的RPMI-1 64

3、0培養(yǎng)基培養(yǎng).應(yīng)用顯微鏡下形態(tài)、電鏡和H.E.染色或免疫組化對肝細(xì)胞和HSEC作鑒定.第二部分:缺氧預(yù)處理對肝細(xì)胞缺氧再灌氧損傷的影響;目的:建立缺血預(yù)處理體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?探討缺氧預(yù)處理對原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞缺氧再灌氧損傷的影響.第三部分:大鼠肝細(xì)胞缺氧預(yù)處理后基因表達(dá)譜的改變;目的:研究缺氧預(yù)處理對大鼠肝細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響,分析其在基因水平上的作用機(jī)制.第四部分:大鼠肝細(xì)胞缺氧預(yù)處理后蛋白質(zhì)分子的二維凝膠電泳和計(jì)算機(jī)圖像分析;目的:尋找缺

4、氧預(yù)處理預(yù)防肝細(xì)胞缺氧再灌氧損傷的相關(guān)蛋白質(zhì)分子,在蛋白質(zhì)水平上探索該現(xiàn)象的機(jī)制.第五部分:肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在肝臟缺血預(yù)處理中的作用;目的:研究HSEC在肝臟缺血預(yù)處理中的作用.小結(jié):IP預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷的機(jī)制十分復(fù)雜,可能通過多個(gè)途徑來實(shí)現(xiàn).肝臟經(jīng)過IP后,肝組織內(nèi)腺苷水平上升,通過腺苷A<,2>型受體的興奮作用使HSEC eNOS mRNA表達(dá)增加,產(chǎn)生大量NO,對抗缺血再灌注損傷.另外,預(yù)處理后肝細(xì)胞內(nèi)一些與防御功能有關(guān)的因子,