長循環(huán)脂質超聲造影劑“脂氟顯”的制備優(yōu)化及評價.pdf

1、研究背景： 新型超聲造影劑的制備及應用研究是近年來超聲醫(yī)學研究的熱點和前沿。超聲造影劑是一種含有高濃度微氣泡的混懸液，與CT、MRI造影劑類似，超聲造影劑可以增強血流與周圍組織的回聲對比，明顯改善超聲影像對組織血流灌注的評價，顯著提高超聲診斷的敏感性和特異性，進一步拓展超聲診斷領域，使超聲診斷由“平掃時代”進入“增強時代”，被譽為超聲診斷領域的第三次革命。此外，超聲造影劑在超聲分子成像以及介入治療方面還有更大的應用潛力，如：通過

2、在造影劑表面結合特異性配體制備靶向超聲造影劑；或利用超聲造影劑微泡攜帶基因或藥物，介導基因轉移或藥物靶向治療等。為此，國外醫(yī)療機構預測，超聲造影劑不久將成為超聲診斷或治療中的常用試劑，具有巨大的社會效益和經(jīng)濟價值。 超聲造影劑的發(fā)展經(jīng)歷了從空氣微泡到氟碳微泡、從白蛋白微泡到脂質微泡的進步，目前的發(fā)展趨勢是脂質或多聚體作為成膜材料、亞微米級或納米級氟碳微泡、穩(wěn)定性好、體內循環(huán)時間長。 我國在超聲造影劑的研究方面起步較晚、發(fā)

3、展較緩，因此，無論是技術、專利，還是市場，目前大部分被歐美公司所壟斷。在市場方面，目前國外已有多種產(chǎn)品上市，包括美國的Optison、Definity和Imageat，歐洲的SonoVue等；而國內沒有自主上市的超聲造影劑，SonoVue是目前國內唯一可以用于臨床的超聲造影劑，但價格昂貴，而且造影增強時間較短。 “脂氟顯”是我科自主研發(fā)的國內第一個脂質氟碳超聲造影劑。它是在國外新一代脂質超聲造影劑的基礎上，通過對脂質材料及制備工

4、藝進行創(chuàng)新性改進后研制成功的，具有完全自主知識產(chǎn)權。初步實驗結果顯示，“脂氟顯”具有微泡產(chǎn)出率高、使用劑量小、造影效果優(yōu)異、持續(xù)時間長等特點，尤其在造影增強時間方面效果顯著，在肝、腎的持續(xù)時間長達30 min以上，優(yōu)于國內外多種超聲造影劑，具有很大的開發(fā)應用價值。但“脂氟顯”只是實驗室的初試產(chǎn)品，很多工藝尚不成熟，表現(xiàn)為：工藝重現(xiàn)性較差，配方及制備工藝未優(yōu)化，工藝流程不完善等。此外，“脂氟顯”的聲學特性、應用價值及方法學、應用的安全性等

5、也有待進一步研究。 研究目的： 1．對“脂氟顯”的配方、制備工藝進行改進、優(yōu)化和完善，以克服工藝重現(xiàn)性較差等不足，為其下一步商品化打下良好的基礎； 2．對改進、優(yōu)化后的“脂氟顯”的理化性狀、聲學特性進行評價； 3．進一步探討“脂氟顯”的應用價值，包括常規(guī)增強顯像、靶向診斷和介入治療等方面。 4．對“脂氟顯”應用的安全性進行評價，包括作為靜脈注射藥物的安全性，以及與診斷超聲聯(lián)合作用的安全性等。

6、 主要方法及技術路線： 1．采用單因素分析或均勻設計等方法，對“脂氟顯”制備的各個環(huán)節(jié)逐一進行考查，分析影響因素，分別進行改進、優(yōu)化和完善； 2．采用光鏡、透射電鏡、激光粒度分析儀和Coulter顆粒計數(shù)儀等對“脂氟顯”微泡的一般性狀、穩(wěn)定性進行評價，包括微泡的形態(tài)、粒徑及分布、濃度、黏度、pH值、表面電位等； 3．采取穩(wěn)定性加速試驗，對脂質凍干粉劑的穩(wěn)定性進行研究； 4．體外條件下，根據(jù)不同機械指數(shù)超

7、聲輻照前后“脂氟顯”造影圖像灰階值的變化，對微泡的耐壓性進行研究； 5．采用低機械指數(shù)實時造影顯像技術，觀察“脂氟顯”對實驗動物正常肝臟、心腔、心肌的造影增強效果以及肝、腎VX2腫瘤的診斷價值； 6．采用寬帶譜分析方法、Church模型方程等對“脂氟顯”微泡的粘彈特性和非線性特性進行研究； 7．分別采用共價結合法和黏附法制備攜RGDS的靶向微泡造影劑，上述同樣方法對微泡的一般性狀進行評價后，采用熒光顯微鏡、流式細

8、胞儀對比觀察兩種方法所制備的靶向微泡RGDS的結合率及結合的牢固程度； 8．采用冷凍干燥法制備載紫杉醇的脂質微泡造影劑，上述同樣方法對微泡的一般性狀進行評價后，采用熒光顯微鏡觀察紫杉醇與微泡是否結合、結合的部位，以反相高效液相色譜法(RP-HPLc)檢測紫杉醇的包封率； 9．通過急性毒性試驗、靜脈用藥的溶血性、血管刺激性試驗、熱原反應以及血流動力學試驗等，對“脂氟顯”作為藥物單獨應用(即不合并超聲輻照)時的安全性進行評價

9、； 10．以伊文思藍作為血管通透性改變的示蹤劑，并通過甲酰胺淬取出組織中伊文思藍，檢測其量的變化，以人體最敏感、也是最重要的心、腦血管作為研究對象，研究診斷超聲和“脂氟顯”聯(lián)合作用時對血腦屏障以及心肌血管通透性的影響； 11．以大鼠空間記憶能力的變化作為腦高級神經(jīng)功能改變的評價指標，評價“脂氟顯”和診斷超聲聯(lián)合作用開放血腦屏障后對大鼠神經(jīng)行為的影響。 主要結果及結論： 1．通過采用機械振蕩法取代超聲振蕩法

10、，改進初次水合時脂質混懸液的制備，優(yōu)化脂質混懸液的凍干工藝，優(yōu)化配方等步驟，不僅使“脂氟顯”的制備流程更加簡化、完善，工藝重現(xiàn)性明顯改善，而且微泡的性狀更加優(yōu)異。突出表現(xiàn)在：(1)微泡的產(chǎn)率明顯提高；(2)微泡的粒徑及粒徑分布更趨理想，從以往單純的微米級微泡變成含部分納米級微泡的亞微米級微泡；(3)微泡的耐壓性更好；(4)微泡的穩(wěn)定性增加；(5)微泡在體內的循環(huán)時間明顯延長。 2．改進、優(yōu)化后“脂氟顯”微泡溶液的共振頻率在2.3

11、 MHz左右，估計微泡的粘彈特性為G<,S>=10MP<,a>,d<,Se>=0.1％R<,0>,μ<,S>=1.49N·S/m<'2>。此結果從理論上評價和解釋了“脂氟顯”微泡所表現(xiàn)出來的優(yōu)異理化性狀。 3．改進、優(yōu)化后“脂氟顯”微泡在一定聲壓激發(fā)下可以產(chǎn)生次諧波信號；次諧波的發(fā)展大致經(jīng)過三個階段：產(chǎn)生、增長和飽和；在外加聲壓增大和減小的過程中，次諧波分量幅度曲線會出現(xiàn)回滯現(xiàn)象?！爸@”微泡在一定聲壓激發(fā)下可以產(chǎn)生次諧波信號

12、的特性，預示著“脂氟顯”微泡在超聲成像以及超聲檢測方面有更好的應用前景。 4．改進、優(yōu)化后“脂氟顯”微泡能長時間增強實驗犬心腔、心肌的灰階顯像，其中對心腔的目測增強持續(xù)時間達1 h以上，是一種長循環(huán)的亞微米級超聲造影劑；“脂氟顯”造影后，實驗兔肝、腎VX2腫瘤的檢出率明顯提高，尤其提高了對肝、腎微小腫瘤的檢出能力；利用“脂氟顯”微泡可以結合特異性配體或攜帶藥物，在方法學上，采用共價結合法比黏附法可以大幅度提高微泡與特異性配體的結

13、合率以及結合的牢固程度。這些研究結果表明，“脂氟顯”不僅在常規(guī)增強顯像方面具有很大的優(yōu)勢，而且在靶向診斷和介入治療方面有更大的應用潛力。 5．大劑量“脂氟顯”微泡經(jīng)靜脈注射后對家兔紅血球無溶血和凝集作用，無任何血管刺激性及熱原反應發(fā)生，對左心室壓、右心室壓、心率也無明顯影響；半數(shù)致死量測定試驗中，注射劑量達常規(guī)使用劑量500倍時，小鼠也無一死亡，最大耐受量試驗也未見明顯異常反應和死亡，其毒性基本等同于生理鹽水，完全符合藥物安全性

14、評價標準，安全閾值很寬，靜脈用藥十分安全。 6．采用“脂氟顯”進行經(jīng)顱腦超聲造影時常規(guī)劑量注射，或心臟超聲造影檢查時常規(guī)劑量5倍的劑量注射，即使采用最高輸出強度的診斷超聲輻照10 min，也不導致大鼠血腦屏障或心肌血管通透性的任何改變。因此，應用“脂氟顯”進行常規(guī)造影檢查是非常安全的。 7．較大劑量“脂氟顯”造影劑注射結合較高機械指數(shù)的診斷超聲輻照可以可逆性的、選擇性的開放大鼠的血腦屏障，其對血腦屏障的開放時間長達4