索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑的制備及體內(nèi)外評(píng)價(jià).pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡(jiǎn)稱肝癌)是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一，其死亡率高居惡性腫瘤的第二位。中國(guó)是肝癌高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率占全球肝癌病人的50％以上。目前，手術(shù)治療仍是肝癌首選和最有效的治療方法，但由于肝癌病情隱匿、潛伏期長(zhǎng)、腫瘤生長(zhǎng)迅速，超過(guò)80％肝癌患者在確診時(shí)已達(dá)晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移而無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療，研究數(shù)據(jù)表明中國(guó)肝癌的5年相對(duì)生存率僅為10.1％。化療仍然是臨床上治療肝癌的

2、主要方法之一。傳統(tǒng)的化療藥物并不能有效改善患者的預(yù)后，分子靶向藥物的出現(xiàn)為肝細(xì)胞癌的治療提供了新的治療手段。
　　索拉非尼是一種多靶點(diǎn)激酶抑制劑。歐美和亞太地區(qū)的兩項(xiàng)隨機(jī)、雙盲的國(guó)際多中心Ⅲ期臨床試驗(yàn)均證實(shí)索拉非尼可顯著延長(zhǎng)晚期肝癌患者的總生存期。基于以上臨床試驗(yàn)結(jié)果，索拉非尼于2007年被美國(guó)食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于晚期肝癌患者，并被多個(gè)指南推薦為晚期肝癌患者的標(biāo)準(zhǔn)一線用藥。索拉非尼在臨床上的應(yīng)用主要為口服片劑，推薦劑量

3、為800 mg每天，但由于胃腸道刺激（包括胃出血）、腹瀉、高血壓等不良反應(yīng)的出現(xiàn)，常常導(dǎo)致劑量降低甚至治療中止。因此，提高藥物靶向性、降低治療的毒副作用成為目前肝癌治療的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，納米藥物的興起為改善肝癌臨床診療困難的現(xiàn)狀帶來(lái)了新的機(jī)遇。
　　脂質(zhì)納米混懸劑(LNS)是納米給藥系統(tǒng)中一個(gè)很有發(fā)展前途的分支，有以下獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):①選用可注射用磷脂作為穩(wěn)定劑，有更好的生物相容性和安全性;②載藥量高，無(wú)藥物泄露問(wèn)題，解決了諸多納米載體

4、載藥量低，藥物易泄露的問(wèn)題，尤其適用于索拉非尼這種劑量大的難溶性藥物;③索拉非尼具有強(qiáng)親脂性(log P=3.8)，以磷脂為穩(wěn)定劑保證了穩(wěn)定劑與藥物的相容性。④可利用增強(qiáng)滲透與滯留效應(yīng)(EPR effect)增加藥物在腫瘤部位的蓄積，在增強(qiáng)抗腫瘤作用的同時(shí)降低藥物對(duì)正常組織的毒副作用。
　　本文首次制備索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑(sorafenib-LNS)作為靜脈注射制劑，以期望達(dá)到增強(qiáng)抗腫瘤效果，降低毒副作用的目的。本課題主要研究

5、內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　1.索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑中藥物含量測(cè)定方法的建立
　　采用高效液相色譜法對(duì)sorafenib-LNS中索拉非尼的含量進(jìn)行測(cè)定，并考察其方法學(xué)。
　　結(jié)果表明，此含量測(cè)定方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度好、精確度高、能準(zhǔn)確測(cè)定索拉非尼的含量。
　　2.索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑及凍干制劑的制備及體外性質(zhì)評(píng)價(jià)
　　首先，采用納米沉淀法制備sorafenib-LNS，利用單因素考察和正交設(shè)計(jì)對(duì)處方工藝進(jìn)行

6、優(yōu)化，并對(duì)最優(yōu)處方進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)考察，包括粒徑及其分布、zeta電位、外觀形態(tài)、載藥量等。為進(jìn)一步提高制劑穩(wěn)定性，在混懸劑中加入甘露糖(5％，W/V)作為凍干保護(hù)劑制備索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑凍干制劑(lyophilized sorafenib-LNS)。然后，采用動(dòng)態(tài)膜透析法以磷酸鹽緩沖液(pH=7.4，1％吐溫-80)為釋放介質(zhì)，在37℃恒溫振蕩箱中以100 rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行釋放行為的考察。此外，以人原發(fā)性肝細(xì)胞癌細(xì)胞(HepG2)

7、與人肝癌細(xì)胞(Bel-7402)為細(xì)胞模型，利用MTT法考察sorafenib-LNS的體外細(xì)胞毒性。最后，對(duì)sorafenib-LNS的體外溶血性進(jìn)行考察。
　　結(jié)果表明，sorafenib-LNS呈類(lèi)球形，粒徑分布均勻，其三批重現(xiàn)的平均粒徑為(164.5±4.5) nm，多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)為0.202±0.015，zeta電位為(11.0±0.2) mV，載藥量為10.55％±0.1

8、6％。lyophilized sorafenib-LNS呈疏松多孔狀態(tài)，再分散性良好，且初步穩(wěn)定性試驗(yàn)證明在4℃、-20℃條件下放置6個(gè)月，凍干制劑的外觀無(wú)明顯變化。此外，體外釋放結(jié)果表明sorafenib-LNS開(kāi)始的10h內(nèi)釋放較快，在隨后的38 h內(nèi)緩慢釋放;MTT結(jié)果顯示，索拉非尼增溶溶液及sorafenib-LNS對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性作用呈濃度依賴性。索拉非尼增溶溶液組與索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑的細(xì)胞生存率沒(méi)有顯著差別(p＞0.05

9、)。當(dāng)濃度大于5μM時(shí)，細(xì)胞與索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑孵育后，細(xì)胞生存率明顯低于索拉非尼增溶溶液(p＜0.01）。與索拉非尼增溶溶液組相比，索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑在HepG2細(xì)胞和Bel-7402細(xì)胞的IC50值顯著降低(HepG2:3.39μM versus8.61μM; Bel-7402.2.65μM versus10.01μM)(p＜0.01)，表明sorafenib-LNS對(duì)兩種肝癌細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于索拉非尼增溶溶液組，在細(xì)胞

10、水平上驗(yàn)證了LNS能夠增強(qiáng)藥物的抗腫瘤效果。溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在此實(shí)驗(yàn)條件下索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑未發(fā)生明顯溶血現(xiàn)象。
　　3.索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑體內(nèi)藥效學(xué)、組織分布及體內(nèi)刺激性研究
　　本文以H22荷瘤昆明小鼠為動(dòng)物模型，以索拉非尼增溶溶液為陽(yáng)性對(duì)照，HPLC法測(cè)定sorafenib-LNS與索拉非尼增溶溶液靜注后在小鼠體內(nèi)各組織及腫瘤部位的濃度，以考察藥物的體內(nèi)分布，并通過(guò)靶向性參數(shù)對(duì)制劑靶向性進(jìn)行評(píng)價(jià)。為更科學(xué)直觀地

11、觀察制劑對(duì)對(duì)藥物分布的影響，本文采用近紅外熒光成像技術(shù)，并選用與索拉非尼性質(zhì)相近的近紅外熒光染料DiR碘化物，進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同制劑靜注后在小鼠各組織的蓄積情況。此外，本課題還對(duì)sorafenib-LNS的體內(nèi)抗腫瘤活性、組織切片和血管刺激性進(jìn)行考察。
　　結(jié)果表明，與索拉非尼增溶溶液組相比，索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑組在瘤組織內(nèi)的藥物濃度明顯增加(p＜0.01)。索拉非尼在腫瘤部位的總靶向效率Te由索拉非尼增溶溶液組的5.96％提高到7

12、.28％（1.22倍），其相對(duì)攝取率re和瘤內(nèi)峰濃度Ce分別為2.26和1.67，證明索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑具有良好的瘤靶向效率。體內(nèi)抗腫瘤結(jié)果表明，sorafenib-LNS組(9 mg/kg)荷瘤昆明小鼠的瘤體積明顯小于索拉非尼增溶溶液靜注組(9 mg/kg)(p＜0.05)及雙倍劑量的索拉非尼增溶溶液口服組(18 mg/kg)(p＜0.05)，具有最高腫瘤抑制率(83.44％)，證明脂質(zhì)納米混懸劑可顯著增強(qiáng)索拉非尼的抗腫瘤效果。組