靶向相變型載HCPT液態(tài)氟碳脂質(zhì)納米造影劑多模態(tài)顯像與治療研究.pdf

1、第一部分、靶向相變型載HCPT液態(tài)氟碳脂質(zhì)納米造影劑FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid的制備及性能檢測(cè)
　　目的：制備一種葉酸修飾的靶向相變型載HCPT液態(tài)氟碳脂質(zhì)納米粒（FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid），檢測(cè)其粒徑電位、穩(wěn)定性、相變特性、藥物含量、藥物釋放及體內(nèi)外靶向性等。
　　方法：采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-超聲法制備靶向相變型載HCPT液態(tài)氟碳脂質(zhì)納米粒FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid，對(duì)

2、其形態(tài)大小特征、粒徑電位、鐵含量進(jìn)行檢測(cè)。并于制備后不同時(shí)間點(diǎn)（0.5h,1h,2h,6h,12h,24h,36h,48h,60h,72h,96h）測(cè)量納米粒粒徑，光鏡下觀察不同溫度下（40℃、45℃、50℃和55℃）納米粒的相變情況，用高效液相色譜法檢測(cè)FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid內(nèi)的藥物含量、體外藥物釋放及低強(qiáng)度聚焦超聲LIFU促進(jìn)藥物釋放。使用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證納米粒FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lip

3、id的靶向性能。
　　結(jié)果：制備的FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid納米乳呈棕褐色，光鏡及熒光顯微鏡下納米粒呈球形或點(diǎn)狀，透射電鏡顯示細(xì)點(diǎn)狀Fe3O4顆粒均勻分布在殼層內(nèi)。Malvern激光粒徑儀檢測(cè)出FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid粒徑321±67nm, Zeta電位為-50mV。原子吸收光譜法測(cè)得不同濃度的FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid納米乳（5μg mL-1，10μg mL-1，20

4、μg mL-1，40μg mL-1，80μg mL-1，160μg mL-1，320μg mL-1，640μg mL-1，1280μg mL-1和2560μg mL-1）中的Fe濃度分別為（0.43±0.08μg mL-1，0.71±0.09μg mL-1，1.63±0.31μg mL-1，3.52±1.21μg mL-1，7.60±1.35μg mL-1，15.05±3.16μg mL-1，29.12±4.05μg mL-1，53.3

5、2±5.25μg mL-1，117.65±6.36μg mL-1和236.37±11.97μg mL-1）。在4℃條件下，納米粒粒徑在48小時(shí)內(nèi)無(wú)明顯增大，48小時(shí)后粒徑緩慢增大。40℃時(shí)納米?；颈３址€(wěn)定，45℃時(shí)部分納米粒發(fā)生液氣相變，體積增大，50℃時(shí)相變納米粒數(shù)量明顯增多，體積增大明顯，55℃時(shí)僅存少量相變納米粒。FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液藥物包封率為60.51%±2.33%，載藥量為8.33%±0.57

6、%。體外藥物釋放試驗(yàn)顯示，F(xiàn)A/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液內(nèi)的藥物HCPT呈緩慢釋放，24小時(shí)釋放約25%，48小時(shí)釋放約60%，60小時(shí)后藥物釋放趨平緩。隨著LIFU強(qiáng)度的增加，藥物釋放量亦隨著增加。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功的制備了造影劑FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid，形態(tài)規(guī)則，大小較均勻，性質(zhì)穩(wěn)定，具有較好的液氣相變的能力，能夠在LIFU作用下釋放藥物。
　　第二部分、FA/Fe3O4/P

7、FP/HCPT@Lipid造影劑增強(qiáng)超聲、光聲及磁共振顯像研究
　　目的：觀察FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影劑體外增強(qiáng)超聲、光聲和磁共振顯像的效果，研究其作為多模態(tài)造影劑的可行性；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)了解FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影劑增強(qiáng)超聲、光聲和磁共振顯像的能力。
　　方法：本部分實(shí)驗(yàn)分為三節(jié)分別進(jìn)行。在第一節(jié)中首先使用加熱的方法，了解在不同溫度條件下納米乳增強(qiáng)超聲顯影的效果，并于顯微鏡下觀

8、察加熱后納米粒相變情況。體外及體內(nèi)聲致相變實(shí)驗(yàn)中，LFIU儀使用不同聲強(qiáng)度（0.8W/cm2、1.6W/cm2、2.4W/cm2、3.2W/cm2）及不同時(shí)間（1min、2min、3min、4min），觀察LIFU輻照后納米乳于體外及體內(nèi)增強(qiáng)超聲顯影的效果，了解導(dǎo)致納米粒相變的最佳LIFU輻照強(qiáng)度及時(shí)間。在第二節(jié)里，將Fe3O4溶液、FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液及FA/PFP/HCPT@Lipid乳液分別行光聲顯影

9、實(shí)驗(yàn)，了解Fe3O4增強(qiáng)光聲信號(hào)的效果。并用不同濃度FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid行光聲顯影，了解光聲信號(hào)強(qiáng)度的變化。在細(xì)胞光聲實(shí)驗(yàn)中，SKOV3細(xì)胞與FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid納米粒孵育不同時(shí)間后觀察細(xì)胞光聲信號(hào)強(qiáng)度。體內(nèi)光聲實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)裸鼠尾靜脈分別注射FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液、Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液和不含F(xiàn)e3O4的造影劑FA/PFP/HCPT@Li

10、pid乳液，于注射之后0.5h、1h、6h分別行光聲顯像。在第三節(jié)里，將FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid納米乳配置成不同的濃度，觀察磁共振顯影的差異。體內(nèi)磁共振實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)裸鼠尾靜脈分別注射FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液、Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液和不含F(xiàn)e3O4的造影劑FA/PFP/HCPT@Lipid乳液，于注射之后0.5h、1h、6h分別行磁共振顯像。
　　結(jié)果：在第一節(jié)中，

11、諧波超聲模式下，水浴鍋溫度為40℃時(shí)，水囊內(nèi)無(wú)增強(qiáng)。45℃和50℃時(shí)，水囊內(nèi)顯影明顯增強(qiáng)。至55℃時(shí)，水囊內(nèi)回聲增強(qiáng)又相對(duì)減弱。于45℃和50℃水囊吸出的乳液在光鏡下可見(jiàn)到較多氣泡產(chǎn)生。體外LIFU聲致相變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2.4W/cm2、2分鐘有最佳的聲致相變效果，此時(shí)顯微鏡下相變氣泡較多。體內(nèi)相變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3.2W/cm2、2分鐘的LIFU條件具有最佳的體內(nèi)相變效果。在第二節(jié)里，F(xiàn)e3O4和FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Li

12、pid乳液顯示較強(qiáng)的光聲信號(hào)，而FA/PFP/HCPT@Lipid乳液幾乎不顯示光聲增強(qiáng)信號(hào)。FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid的光聲信號(hào)隨著 Fe3O4濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。細(xì)胞光聲實(shí)驗(yàn)中，隨著納米粒與SKOV3細(xì)胞孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，光聲信號(hào)明顯增加。體內(nèi)光聲實(shí)驗(yàn)中，注射FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液的裸鼠其腫瘤于注射后1小時(shí)顯示明顯光聲信號(hào)，腫瘤局部光聲信號(hào)強(qiáng)度值明顯高于另外兩組（P＜0.05）。在第三

13、節(jié)的體外實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)A/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid呈現(xiàn)磁共振負(fù)性顯影，且隨著裝載的Fe3O4濃度的增加，MR信號(hào)強(qiáng)度逐漸下降。體內(nèi)磁共振實(shí)驗(yàn)中，注射FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid的裸鼠其腫瘤于注射后1小時(shí)顯示明顯磁共振負(fù)性顯影信號(hào)，腫瘤局部磁共振信號(hào)強(qiáng)度值明顯低于另外兩組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影劑能夠于體內(nèi)外增強(qiáng)超聲、光聲和磁共振顯像，具備成為多模

14、態(tài)造影劑的潛能。
　　第三部分、FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影劑靶向治療卵巢癌實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：了解FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影劑及藥物HCPT在裸鼠體內(nèi)的分布情況，以及FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影劑對(duì)SKOV3卵巢癌的靶向治療效果。
　　方法：造影劑及藥物體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)：將30只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為兩組，分別經(jīng)尾靜脈注射攜熒光DiI的造影劑FA/Fe3O4/

15、PFP/HCPT@Lipid乳液和Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液，于注射后0.5h，1h，6h，12h，24h脫頸處死裸鼠，瘤塊行超薄切片，顯微鏡下觀察切片內(nèi)造影劑分布情況。取50只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為兩組，分別經(jīng)尾靜脈注射HCPT注射液和FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid納米乳，于注射后0.5h，1h，6h，12h，24h眼球取血處死裸鼠，檢測(cè)血清內(nèi)藥物濃度分布，同時(shí)取裸鼠重要臟器及腫瘤組織勻漿后行高效液相色譜法

16、檢測(cè)各組織內(nèi)藥物濃度。另外檢測(cè)LIFU作用后腫瘤局部藥物濃度分布。
　　靶向治療實(shí)驗(yàn)：將30只裸鼠隨機(jī)分為6組,分別給予不同的處理：FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid+LIFU組；FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid注射液組；HCPT組； FA/Fe3O4/PFP@Lipid+LIFU組；Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid注射組；生理鹽水組。治療后測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)曲線及抑瘤率。行免疫組織化學(xué)檢

17、測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。
　　結(jié)果：造影劑及藥物體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)：靶向組腫瘤超薄切片各時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)熒光，1小時(shí)熒光最明顯。而非靶向組未見(jiàn)熒光顯示。在每一個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，F(xiàn)A/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid納米乳組裸鼠的血藥濃度均高于 HCPT注射液組。FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid注射液組的腫瘤組織藥物濃度顯著高于HCPT注射組(P＜0.05)，而FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid+LIFU組的腫瘤

18、組織藥物濃度顯著高于FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid納米乳注射液組(P＜0.05)。
　　靶向治療實(shí)驗(yàn)：FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid+LIFU組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)指數(shù)最低，抑瘤率最高。免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)A/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid+LIFU組的增殖指數(shù)最低（P＜0.05），凋亡指數(shù)最高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：納米粒FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid可以延緩藥物HC