液態(tài)氟碳納米脂質微粒靶向識別存活心肌實驗研究.pdf

1、本研究旨在制備一種以脂質成分為外膜，液態(tài)氟碳（PFOB）為核心的納米微粒超聲造影劑，檢測其粒徑、表面電位、穩(wěn)定性等理化性質及顯影效果，并將其與包裹氟碳氣體（C3F8）的脂質微泡造影劑進行比較，探討兩者之中哪種更符合超聲靶向造影的要求；嘗試通過單克隆抗體－生物素－親和素－生物素橋連，使自制的液態(tài)氟碳納米脂質微粒靶向結合至存活心肌上，特異性增強存活心肌的超聲信號，從而實現(xiàn)超聲靶向造影對存活心肌的識別。本研究包括以下兩個部分：
　　

2、第一部分：PFOB 納米脂質微粒與C3F8 納米脂質微泡一般性質及顯影效果比較：體外研究
　　 目的制備PFOB 納米脂質微粒與C3F8 納米脂質微泡，比較兩者一般理化性質,體外顯影效果及耐聲壓性。方法分別制備PFOB 納米脂質微粒與C3F8 納米脂質微泡，檢測兩種造影劑形態(tài)、粒徑、表面電位、濃度以及穩(wěn)定性，并進行比較。制備生物素化（外膜標記生物素）及空白（外膜未標記生物素）的PFOB 脂質微粒及C3F8 微泡造影劑。以高頻探頭

3、分別在基波及CPS兩種成像模式下觀察各組造影劑加入親和素前、后的顯影效果，并運用METLAB 軟件分析比較。調節(jié)探頭輸出功率，使MI為0.28與0.56兩個水平上對PFOB 脂質微粒及C3F8 脂質微泡進行超聲輻照，分別于輻照10s，20s，30s后，觀察顯影情況有無變化，并運用METLAB 軟件分析比較。結果①PFOB 脂質微粒與C3F8 脂質微泡粒徑分別為（152.30±35.99）nm，（774.59±108.59）nm，前者明顯

4、小于后者（P＜0.05）；表面電位分別為（-40.90±6.51）Mv，（-14.80±3.97）Mv，前者明顯大于后者（P＜0.05）。②PFOB 脂質微粒造影劑的濃度及粒徑，在整個觀察期間內無明顯改變。C3F8 脂質微泡造影劑制備后放置12h 以內，濃度尚未發(fā)生明顯改變，而放置24h，2d，4d及1w后濃度較0h 明顯減低（P<0.05）；C3F8 微泡造影劑放置2d內粒徑尚未見明顯變化，放置4d及1w后粒徑較0h 明顯增大（P<0

5、.05）。③顯微鏡下觀察，空白PFOB 脂質微粒及C3F8 脂質微泡加入親和素前、后微粒分散度均較好，未見明顯變化；生物素化PFOB 脂質微粒及C3F8 脂質微泡加入親和素前分散度良好，而加入親和素后均發(fā)生聚集現(xiàn)象。空白PFOB 脂質微粒及C3F8 脂質微泡加入親和素前、后粒徑均無明顯變化，生物素化PFOB 脂質微粒及C3F8 脂質微泡加入親和素后粒徑均較加入前明顯增大（P<0.05）。④基波成像模式下體外顯影結果顯示，加入親和素前，空

6、白及生物素化PFOB 脂質微粒則均未見明顯顯影，而空白及生物素化C3F8 脂質微泡均有較好的顯影效果；加入親和素之后，生物素化PFOB 脂質微粒造影劑顯影明顯增強（P<0.05），而空白PFOB 脂質微粒及兩組脂質C3F8 微泡顯影情況無明顯改變。⑤CPS 成像模式下體外顯影結果顯示，生物素化PFOB 脂質微粒造影劑加入親和素之前及之后均未見明顯信號顯示，兩者間無明顯差異；而生物素化C3F8 脂質微泡造影劑加入親和素之前及之后均可見良好

7、的顯影效果，兩者的顯影強度亦無明顯差異。⑥耐聲壓性測定結果顯示，PFOB 脂質微粒造影劑在低聲壓（MI=0.28）及高聲壓（MI=0.56）環(huán)境下，隨輻照時間延長，顯影強度均未見明顯改變。C3F8 脂質微泡造影劑在低聲壓（MI 0.28）環(huán)境下，輻照10s后顯影強度尚未見明顯改變，輻照20s后顯影強度明顯減低（P<0.05），輻照30s后顯影強度進一步減低（P<0.05）；而在高聲壓（MI 0.56）環(huán)境下，輻照10s后顯影強度即明顯減

8、低（P<0.05），輻照20s，30s后顯影強度進一步減低（P<0.05）。結論與C3F8 脂質微泡造影劑相比，以PFOB為核心的納米脂質微粒造影劑無論是穿透性，穩(wěn)定性，耐聲壓性能還是靶向顯影“信噪比”上均更勝一籌，更符合靶向超聲造影劑的要求，具有更為廣闊的臨床應用前景。
　　
　　 第二部分：PFOB 納米脂質微粒對大鼠缺血－再灌注模型中存活心肌靶向顯影研究
　　 目的制備一種靶向識別存活心肌的PFOB 納米脂

9、質微粒造影劑，觀察其體內靶向顯影效果。方法制備表面標記有生物素及熒光的PFOB 納米脂質微粒造影劑，檢測其粒徑、表面電位、濃度等理化性質。將生物素標記的MCP-1抗體、羅丹明標記的親和素、生物素及熒光標記的脂質微粒造影劑依次注入大鼠缺血－再灌注模型體內，觀察其靶向顯影效果。12小時后取心臟標本進行冰凍切片，并在熒光顯微鏡下觀察熒光顯示情況。取大鼠心臟行TTC-EB 染色及HE 染色病理切片，將超聲顯影及熒光顯微鏡觀察結果與病理結果進行對

10、照。結果①自制PFOB 納米脂質微粒造影劑熒光顯微鏡下分散均勻，外膜呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，粒徑為（178.80±43.07）nm，表面電位分別為（-36.7±4.64）Mv，濃度為(2.35±0.57)×1011/ml。②TTC-EB 染色及HE 染色病理切片結果顯示造膜成功模型，左室前壁及室間隔區(qū)域心肌發(fā)生梗死，左室前壁部分區(qū)域尚存在存活心肌，而左室后壁、下壁及側壁為正常心肌。③于靶向造影過程中觀察缺血－再灌注大鼠短軸切面發(fā)現(xiàn)，靶向造影