2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
  前列腺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的一種惡性腫瘤,在歐美男性中高發(fā),據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計(jì),2014年,男性腫瘤患者中,前列腺癌發(fā)病率居第一,為27%。前列腺癌早期癥狀不明顯或者沒有特異性,早期診斷困難,而早期診斷對治療效果和預(yù)后有著重要意義,目前主要通過直腸指診、前列腺特異性抗原生化指標(biāo),影像學(xué)檢查方法如超聲,CT和磁共振來做出診斷,目前的檢查方法對于早期診斷的敏感性和特異性不足,確診時多已為晚期。早期診斷對成像技術(shù)和方法提出了

2、更高的要求。
  近年來,分子影像學(xué)和納米技術(shù)的進(jìn)步使得多模態(tài)的納米材料有了較快的發(fā)展,可用于腫瘤的發(fā)現(xiàn)、診斷和治療。特異性分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、高親和力分子探針的設(shè)計(jì)及合成是推動分子影像學(xué)發(fā)展的動力。另外,由于腫瘤組織血管結(jié)構(gòu)不同而引起的增強(qiáng)的通透性及滯留效應(yīng)(EPR),有利于納米材料在腫瘤組織的富集。理想的分子探針為特異性強(qiáng)、成像質(zhì)量好,對比度高,生物安全性好的納米材料。
  胃泌素釋放肽受體(Gastrin releasin

3、g peptide receptor,GRPr)是一種G蛋白偶聯(lián)受體,在前列腺癌細(xì)胞,乳腺癌細(xì)胞等許多腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)。GRPr在前列腺癌細(xì)胞表面高表達(dá),而正常前列腺細(xì)胞和良性前列腺增生組織則不表達(dá)GRPr。鈴蟾肽(bombesin,BBN),是一個含有14個氨基酸殘基的多肽,由于其與27肽的胃泌素釋放肽的有著相似的結(jié)構(gòu),因此對于GRPr有著很高的親和力和特異性??梢杂米鞣肿佑跋駥W(xué)的一個靶點(diǎn)。目前BBN及其類似物已經(jīng)開始用于GRPr陽

4、性的腫瘤的研究。
  氧化釓納米顆粒,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有應(yīng)用,由于其實(shí)是順磁性物質(zhì),可以是縮短T1弛豫時間,可作為MR陽性對比劑,在增強(qiáng)對比度的同時還可以與多種配體連接,可用于多模態(tài)活體成像。在本研究中,我們嘗試合成以GRPr為靶點(diǎn),鈴蟾肽BBN修飾、帶熒光標(biāo)記的順磁性雙模態(tài)納米微粒Gd2O3-FI-PEG-BBN,并且對所制備的Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒的理化特性、細(xì)胞毒性、體外主動靶向PC-3細(xì)胞以及體內(nèi)MR成像

5、的效果等進(jìn)行了初步評價(jià),通過表面修飾使納米微粒能同時發(fā)揮順磁性及熒光對比劑的作用,可實(shí)現(xiàn)光學(xué)-MR雙模態(tài)成像的對比增強(qiáng),有利于早期診斷前列腺腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶,也為實(shí)時監(jiān)測藥物療效與體內(nèi)分布情況等探索新的途徑。
  目的:
  1.制備鈴蟾肽和熒光素雙標(biāo)記的氧化釓納米微粒Gd2O3-FI-PEG-BBN,來作為一種靶向的MRI對比劑,并對其理化性質(zhì)進(jìn)行測定和評價(jià)。
  2.培養(yǎng)胃泌素釋放肽受體(GRPr)陽性的人前列腺癌細(xì)

6、胞系PC-3,評價(jià)Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒的細(xì)胞毒性和體外靶向前列腺癌細(xì)胞的有效性。
  3.制備前列腺癌荷瘤裸鼠模型,探討Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微?;铙w腫瘤靶向成像的可能性和體內(nèi)成像的特點(diǎn)
  材料和方法:
  1.合成和評價(jià)
  1.1 合成
  1.1.1 Gd2O3納米微粒的制備:
  取Gd(OAC)3(670mg,2mmol)溶解在30mLDMSO中,攪拌均勻

7、后緩慢滴加四甲基氫氧化銨(TMAH,200mg,5.6mmol)和10mL無水乙醇混合物。溶液室溫下攪拌2h后離心分離,固體用乙醇洗滌三次得到Gd2O3。
  1.1.2 Gd2O3-FI的制備:
  取Gd2O3(400mg)分散在DMSO中,加入5(6)-羧基熒光素(100mg),室溫下攪拌12h后離心分離,固體分別用DMSO,乙醇和二氯甲烷洗滌三次得到熒光素表面修飾的Gd2O3。
  1.1.3 Gd2O3-FI

8、-PEG的制備:
  取Gd2O3-FI(200mg)分散在DMSO中,加入a-羧基,w-羥基聚乙二醇(分子量2000)(100mg),室溫下攪拌12h后離心分離,固體分別用DMSO,乙醇和二氯甲烷洗滌三次得到PEG和熒光素表面修飾的Gd2O3。
  1.1.4 Gd2O3-FI-PEG-BBN的制備:
  采用傳統(tǒng)的FMOC固相合成方法合成的鈴蟾肽BBN(7-14),取Gd2O3-FI-PEG(100mg)分散在DM

9、SO中,加入BBN(20mg),EDC.HCl(20mg)和4-二甲氨基吡啶DMAP(10mg),室溫下攪拌12h后離心分離,固體分別用DMSO,乙醇和二氯甲烷洗滌三次得到攜BBN、PEG和熒光素表面修飾的Gd2O3。
  1.2評價(jià)和表征
  1.2.1 采用TEM觀察Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒形態(tài)、大小
  Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒用去離子水稀釋后,滴于敷有雙面支撐膜的銅網(wǎng)上,靜置約5

10、分鐘后,用濾紙小片從銅網(wǎng)邊緣吸干多余液體,靜置干燥后,置透射電子顯微鏡下觀察納米微粒子的大小和形態(tài)。
  1.2.2 采用Malvem-3000HS激光粒度分析儀進(jìn)行納米微粒粒徑及分布的測定用Malvem Zetasizer3000HS激光散射粒度分析測定Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒的粒徑及分布,取5ul,用蒸餾水稀釋至測量杯中,放入樣品槽中測試。
  1.2.3 傅里葉變換紅外光譜分析儀(FTIR)分析Gd2O

11、3 and Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒的紅外光譜
  將Gd2O3納米微粒、Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒懸液滴在硒化鋅窗片上,吹干,用FTIR儀掃描,掃描范圍為4000-400cm-1。
  2.Gd2O3-FI-PEG-BBN腫瘤靶向體外實(shí)驗(yàn)研究
  選用的GRPr表達(dá)陽性的人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3來自美國ATCC,用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗的的DMEM高糖培養(yǎng)液,放入5%C

12、O2、37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。選擇對數(shù)期生長細(xì)胞備用。
  2.1 Gd2O3-FI-PEG-BBN體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
  通過MTT法和PC-3細(xì)胞來檢測Gd2O3-FI-PEG和Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒的毒性。接種3000個PC-3細(xì)胞/孔于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,培養(yǎng)過夜。細(xì)胞已貼壁,吸去培養(yǎng)液,每孔加入經(jīng)0.45um過濾器濾過除菌的Gd2O3-FI-PEG或Gd2O3--FI-PEG-BBN納米微粒培養(yǎng)基懸

13、液,設(shè)6個濃度梯度,分別為每孔含Gd0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L,每組設(shè)6個復(fù)孔,僅含培養(yǎng)基無細(xì)胞的6個孔作為調(diào)零孔,含等量細(xì)胞的不加藥的完全培養(yǎng)基的6個孔作為對照組。分別培養(yǎng)24h和48h后,加MTT(5mg/mL)溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸除培養(yǎng)液,每孔加入150ul DMSO,平板震蕩儀震蕩10min,在酶標(biāo)儀(ELX80,BIOTEK,USA)中測定490nm波長處的吸光度值(OD

14、值),按照此公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照孔OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。
  2.2 體外靶向攝取實(shí)驗(yàn)
  2.2.1 熒光顯微鏡觀察靶向攝取實(shí)驗(yàn)
  將PC-3細(xì)胞的單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度,以4×105個/每孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h,吸去培養(yǎng)液,分為3組,每組2孔,實(shí)驗(yàn)組每孔加入溶有Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒(

15、含Gd0.8 mmol/L)的DMEM完全培養(yǎng)液2ml,對照組每孔加入溶有Gd2O3-FI-PEG納米微粒(含Gd0.8 mmol/L)的DMEM完全培養(yǎng)液2ml,空白對照組每孔加入DMEM完全培養(yǎng)液2ml,繼續(xù)孵育4h后,吸去上清培養(yǎng)液,再用PBS液洗滌三遍,每孔加入4%多聚甲醛溶液0.5ml,固定15min后,用PBS液洗三遍,每孔加入DAPI染液100ul,室溫下染3-5min后用PBS液洗三遍,每孔滴加約100ul的PBS液,倒

16、置熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記成功率。
  3.Gd2O3-FI-PEG-BBN腫瘤靶向體內(nèi)成像研究
  3.1 建立前列腺癌荷瘤裸鼠模型
  在無菌條件下,將含有6×106個PC-3細(xì)胞的150μL細(xì)胞懸液注射入裸鼠的右側(cè)肩背部皮下,約30天后,腫瘤直徑達(dá)到1.0-2.0cm,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(靶向組)和對照組(非靶向組),備用。
  結(jié)果:
  1制備和評價(jià)
  1.1 TEM觀察Gd2O3-FI-PEG-

17、BBN納米微粒形態(tài)、大小
  Gd2O3-FI-PEG-BBN在透射電子顯微鏡下粒子呈球形,大小均勻,僅有少量聚集現(xiàn)象,分布較均勻,電子顯微鏡下估算其平均粒徑大小約50-60nm。
  1.2 Malvem-3000HS激光粒度分析儀進(jìn)行納米微粒粒徑及分布的測定
  Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒通過Malvern-3000HS激光粒度分析儀來測定,Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒粒徑分布集中,峰數(shù)為

18、1,平均粒徑約為90nm。
  2.Gd2O3-FI-PEG-BBN腫瘤靶向體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究
  3.Gd2O3-FI-PEG-BBN腫瘤靶向體內(nèi)成像研究
  結(jié)論:
  本研究成功制備了鈴蟾肽BBN和熒光素FI雙標(biāo)記的氧化釓納米顆粒Gd2O3-FI-PEG-BBN分子探針,有較好的水溶性、生物相容性、熒光顯像及MRIT1增強(qiáng)效果好,能選擇性地在前列腺癌腫瘤組織富集,能有效進(jìn)行熒光顯像和MR成像,可用于光學(xué)-MR

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