RGD修飾的蟾毒靈多級靶向納米粒的制備及其治療大腸癌的機制研究.pdf

1、研究目的：
　　 建立具有主動靶向和緩釋作用的蟾毒靈載藥納米粒的制備工藝和質量標準；探討其藥物釋放規(guī)律、體內外藥物靶向分布、對人結腸癌細胞的生長抑制作用和對裸鼠結腸癌的治療作用，揭示其藥理學機制。
　　 研究方法：
　　 蟾毒靈多級靶向納米粒制備方法：選用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、多聚左旋賴氨酸(PLL)為載體材料與RGD共修飾，采用乳化溶劑蒸發(fā)法，建立RGD修飾的蟾毒靈多級靶向納米粒(BufalinN

2、anoparticles，BNP)的制備方法，先后考察了7個因素對納米粒形成的影響，采用正交實驗優(yōu)化了BNP的制備工藝。
　　 對蟾毒靈多級靶向納米粒的有關理化性質進行研究：掃描電鏡照片評價納米微粒表面結構；光學顯微鏡觀察納米粒的粒徑分布；檢測蟾毒靈多級靶向納米粒的包封率、載藥量等，并觀察體外藥物釋放規(guī)律。
　　 蟾毒靈多級靶向納米粒靶向分布實驗：Rb做熒光探針包裹于納米粒中，激光共聚焦顯微鏡下觀察攝入到細胞中納米粒的分

3、布情況；活體成像儀對荷SW620腸癌小鼠進行活體靶向熒光成像，觀察載藥納米粒的體內分布情況。
　　 蟾毒靈多級靶向納米粒體外抗腫瘤實驗：CCK-8法觀察BNP細胞毒性，以及對人腸癌SW620細胞株的生長抑制作用。
　　 蟾毒靈多級靶向納米粒治療裸鼠腸癌的作用：建立裸鼠移植性腸癌模型并隨機分為如下六組分別經尾靜脈給藥：對照組(生理鹽水，NS，13.5ml/kg)；蟾毒靈組(Bufalin，1mg/kg)；mPEG-PLGA

4、-PLL納米組(mPEG-PLGA-PLLNPs，24.5mg/kg)；mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米組(mPEG-PLGA-PLL-cRGDNPs，24.5mg/kg)；蟾毒靈mPEG-PLGA-PLL納米組(bufalin-mPEG-PLGA-PLL，含藥1mg/kg)；mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米組(bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD，含藥1mg/kg)。比較治療后各組裸鼠的腫瘤生長情況、腫

5、瘤壞死程度和生存時間。
　　 結果：
　　 蟾毒靈多級靶向納米粒的制備及有關理化性質：以乳化溶劑蒸發(fā)法制備的蟾毒靈多級靶向納米粒，納米粒大小均勻，外形圓整，平均粒徑為164±84nm，Zeta電位為2.77mv，包封率和載藥量分別為81.7±0.89％、3.92±0.16％。制成納米制劑后與游離的蟾毒靈單體相比釋放速度明顯減慢，在24小時后，游離的蟾毒靈單體釋放已達90％，而蟾毒靈多級靶向納米粒釋放僅為50％，蟾毒靈多級

6、靶向納米粒在192小時后釋放達90％。
　　 藥物分布研究：用Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL納米粒培養(yǎng)的HUVECs的熒光強度，要明顯低于用Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒培養(yǎng)的HUVECs的熒光強度。靜脈給藥后4小時，與Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL納米粒相比，注射Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的荷瘤裸鼠腫瘤部位的熒光強度要強

7、，但差別不明顯。靜脈給藥后24小時，注射Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的荷瘤裸鼠腫瘤的熒光強度逐漸增強。而且與Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL納米粒相比，注射Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的荷瘤裸鼠腫瘤部位顯示出較高的熒光強度。
　　 體外抗腫瘤實驗：CCK-8比色法觀察SW620細胞生存率，隨著濃度的增加，mPEG-PLGA-PLL和mPEG-

8、PLGA-PLL-cRGD空白納米粒的細胞生存率在96％到90％之間，無明顯變化，與Bufalin相比，載Bufalin納米粒的細胞毒性明顯增加。從BNP中釋放的Bufalin對人腸癌SW260細胞株的生長抑制率均有顯著的抑制作用，其作用與劑量和作用時間成正相關。
　　 蟾毒靈多級靶向納米粒治療裸鼠腸癌的作用：治療后蟾毒靈多級靶向納米粒與等劑量蟾毒靈相比，對裸鼠腸癌腫瘤生長抑制更明顯，生存期更長。
　　 結論：
　

9、　 1.本研究采用乳化蒸發(fā)法建立了RGD修飾的蟾毒靈多級靶向納米粒制備方法、質量評價方法。
　　 2.與蟾毒靈相比，蟾毒靈多級靶向納米粒隨著時間的延長能夠將藥物逐步釋放出來，在384小時累積釋放量為(31.77±2.08)％，具有良好的緩釋特征。
　　 3.Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的細胞攝取效率要明顯高于Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL納米粒，活體熒光成像顯示Rb

10、-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒能更有效地靶向腫瘤，這表明RGD修飾的蟾毒靈多級靶向納米粒具有較好的腫瘤靶向作用。
　　 4.mPEG-PLGA-PLL和mPEG-PLGA-PLL-cRGD空白納米粒的細胞生存率在96％到90％之間，表明載體材料其基本無毒性。與Bufalin相比，載Bufalin納米粒的細胞毒性明顯增加，表明蟾毒靈多級靶向納米粒能有效提高Bufalin的細胞毒性，這將有助于提高腫瘤治