靜息大腸癌干細胞的鑒定及其IFN--γ靶向清除研究.pdf

1、研究背景：
　　大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率居男性腫瘤第三位，女性腫瘤第二位。近年來，隨著干細胞領(lǐng)域的發(fā)展和對腫瘤的不斷深入研究，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤存在各種不同克隆的癌細胞，這些不同亞群細胞之間存在不同分工，其分裂增殖能力也大相徑庭。其中有一小群細胞與正常干細胞存在許多共性，包括分化、自我更新能力等，多處于休眠狀態(tài)或分裂緩慢，并有強的致瘤性和對治療的抵抗，其活性受Hedghog、Wnt和BMP等信號通路調(diào)節(jié)，因此

2、將其命名為腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)。盡管這部分CSC細胞數(shù)量極少，但其對傳統(tǒng)的放化療非但不敏感，反而可以在治療后被富集，因此CSC的存在被認為目前許多腫瘤無法治愈的根本所在。
　　與生殖干細胞不同，成體干細胞包括CSC多處于靜息狀態(tài)，后者即靜息腫瘤干細胞(quiescent cancer stem cell，QCSC)，這種近似于休眠的低代謝狀態(tài)造成其對放化療不敏感，一旦被重新“喚醒”迅速增殖分裂造成

3、腫瘤復(fù)發(fā)。相比于身體其他器官，腸道有其特殊性。目前認為腸道中同時存在快速分裂與休眠狀態(tài)兩種干細胞，前者維持著腸道上皮細胞的頻繁更新，而對后者的認識直到近年才逐漸明朗。研究人員發(fā)現(xiàn)正常情況下兩種細胞均可分化為各類腸道上皮細胞，但在一定劑量放射殺傷后，只有后者能夠重建腸道上皮，并且部分分化為快速分裂的干細胞。由此可見在腸道中，靜息干細胞才是根源。目前對于大腸癌靜息腫瘤干細胞(quiescent colon cancer stem cell，

4、QCCSC)的研究鮮有報道，根據(jù)CSC理論，我們有理由推測QCCSC是腫瘤發(fā)生、耐藥和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的重要原因。
　　如何有效清除QCSC仍是迄今腫瘤研究的熱點與難點。有限的研究表明CSC可特異性高表達一些抗原，使其更容易受到殺傷性免疫細胞及相關(guān)細胞因子的攻擊。有報道δγT細胞能特異性殺傷卵巢癌及大腸癌CSC; QCSC特異性高表達NK細胞相關(guān)配體，從而更容易受到NK細胞的攻擊;IFN-α/β能特異性殺傷卵巢癌及膠質(zhì)瘤CSC。以上證據(jù)表

5、明，免疫治療可能成為CSC靶向治療的一種新的策略。
　　從時間維度上來看，靜息只是一個相對的細胞周期狀態(tài)。細胞從活躍分裂期轉(zhuǎn)為分裂停滯往往存在四個結(jié)局:老化，凋亡，分化和靜息。因此并非所有腫瘤細胞從分裂期停滯后就等同于QCSC，而只有具有干細胞特征的一小群細胞才能可逆性的在靜息期與活躍分裂期之間轉(zhuǎn)換。雖然QCSC可能只是普通腫瘤細胞的前一個狀態(tài)，但是大量研究表明兩者在代謝，基因表達等方面有著巨大的差別，而這種差別很大程度上與表觀修

6、飾有關(guān)，其中microRNA是一個重要的表觀調(diào)控機制。
　　microRNA為長度約18-25個堿基的單鏈非編碼RNA，可在基因轉(zhuǎn)錄后階段促使靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過程。miRNA不僅在胚胎發(fā)育階段起著重要作用，疾病情況下尤其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，以及對CSC的生物學行為調(diào)控同樣發(fā)揮著明顯的生物學作用。如miR-155可抑制E-caderin，上調(diào)ZEB1等促進腫瘤轉(zhuǎn)移增殖;let-7家族則可通過下調(diào)

7、STAT3信號通路抑制腫瘤;miR-200c可以抑制BMI1調(diào)控乳腺癌干細胞的自我更新;miR-20a通過上調(diào)AKT信號通路及抑制PTEN促進CSC的耐藥及EMT。然而microRNA在QCSC中的調(diào)控機制目前尚不明了。
　　CSC在腫瘤組織中處于核心位置，而QCSC則是其中非常重要的組成部分，具有明顯區(qū)別于普通腫瘤細胞的惡性生物學特性，其與普通腫瘤細胞之間的差異分子亦可成為腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵分子。研究QCCSC的靶向清除與mi

8、RNA調(diào)控機制不僅可進一步探究大腸癌發(fā)生發(fā)展中表觀遺傳學調(diào)控機制，也可為大腸癌治療提供新的靶點和思路。
　　研究方法：
　　本課題利用原代大腸癌細胞及ATCC標準細胞系，首先通過PKH細胞膜染色結(jié)合無血清克隆球培養(yǎng)體系分離出靜息大腸癌細胞，并通過一系列功能學實驗（耐藥性，克隆球形成能力，動物體內(nèi)成瘤實驗，干細胞基因檢測）鑒定其CSC特性;在此基礎(chǔ)上，通過凋亡檢測評價了QCCSC與其他亞群細胞對IFN-γ的敏感性;結(jié)合實驗結(jié)果

9、，比較不同亞群細胞IFN-γR的表達差異，同時通過蛋白免疫印跡實驗，激光共聚焦等方法檢測了不同亞群細胞在IFN-γ刺激下凋亡通路的激活狀況。之后進一步通過對QCCSC與其他亞群的miRNA芯片比較，結(jié)合生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)miR-4666-3p在QCCSC顯著低表達于其他亞群細胞，同時通過蛋白質(zhì)免疫印跡，熒光素雙報告基因等方法驗證IFN-γR是miR-4666-3p的靶基因。最后，我們構(gòu)建了miR-4666-3p高表達/抑制細胞系，通過

10、克隆球形成，干細胞基因檢測，動物成瘤等實驗檢測了miR-4666-3p對QCCSC自我更新及分化的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.PKHhi大腸癌細胞具有低增殖速度及腫瘤干細胞特征
　　結(jié)合PKH細胞膜染色及無血清克隆球培養(yǎng)技術(shù)，我們將PKHhi細胞(熒光值＞103)定義為靜息大腸癌細胞，其余細胞根據(jù)熒光強度分為PKHlow(熒光值102-103)與PKHneg(熒光值＜102)亞群。通過PY-Hoeschest333

11、42雙染流式細胞檢測（flow cytometry，F(xiàn)CM）分析，PKHhi細胞大部分處于G0期(78.07±1.98％)，而PKHlow與PKHneg細胞則大部分處于分裂期或分裂前期。再通過PKH及7-AAD雙染后FACS分選得到PKHhi（0.87±0.30％），PKHlow(39.2±11.58％)及PKHneg（58.2±8.32％）亞群細胞;克隆球形成實驗證明PKHhi細胞具有極強克隆球形成實驗，同時其能夠被奧沙利鉑富集，高表

12、達干細胞基因及高裸鼠體內(nèi)成瘤能力，我們證實了PKHhi細胞是一群同時具有低分裂增殖速度與干細胞特征的細胞亞群。
　　2.PKHhi細胞是一群獨特的腫瘤干細胞亞群。
　　對PKHhi細胞進行了大腸癌CSC相關(guān)標記物的檢測，結(jié)果顯示相比于PKHlow與PKHneg細胞亞群(PKHlow CD133+，16.4±3.3％; CD44+/CD24+，27.8±7.2％;ALDH1+,3.7±1.4％; PKHneg CD133+,1

13、.5±1.4％; CD44+/CD24+,4.7±1.1％;ALDH1+，0％)，PKHhi細胞雖然高表達大腸癌干細胞標記（CD133+，57.5％±13.3％;CD44+/CD24+，71.6％±11.8％; ALDH1+，16.3％±2.1％），但這些傳統(tǒng)大腸癌CSC表面標志物只表達于部分PKHhi細胞，反之亦然。說明QCCSC不能為傳統(tǒng)大腸癌腫瘤干細胞標志物所替代。此外，Lgr5+細胞被認為是一群快速分裂的具有大腸癌CSC亞群，F(xiàn)

14、CM檢測顯示PKHhi與Lgr5相互間幾乎不存在共表達，同時連續(xù)時間點激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PKHhi細胞在進入增殖分裂后Lgr5表達逐漸增強，提示其兩者可能存在譜系關(guān)系。
　　3.IFN-γ選擇性殺傷靜患大腸癌腫瘤干細胞
　　Annexin-Ⅴ及7-AAD雙染結(jié)果顯示，IFN-γ能特異性抑制大腸癌細胞的克隆球形成，且呈劑量依賴性，提示IFN-γ對CCSC可能存在特異性殺傷作用。然后，我們分別檢測了PKHhi，PKHlo

15、w及PKHneg對奧沙利鉑及IFN-γ殺傷作用的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PKHhi細胞對奧沙利鉑明顯存在化療抵抗，但相比PKHlow及PKHneg細胞，其對IFN-γ誘導的細胞凋亡更為敏感;而PKHlow及PKHneg則恰恰相反，更容易被奧沙利鉑殺傷而對IFN-γ不敏感。據(jù)此，我們通過體外實驗比較IFN-γ與奧沙利鉑不同時序組合殺傷PKHhi效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)IFN-γ同時聯(lián)合奧沙利鉑可以同時殺傷PKHhi，PKHlow及PKHneg細胞，裸鼠移植瘤模

16、型也證實IFN-γ聯(lián)合奧沙利鉑抑瘤效果最為明顯。
　　4.靜患大腸癌干細胞特異性高表達IFN-γ受體。
　　根據(jù)上述實驗結(jié)果，我們試圖探索PKHhi對IFN-γ高敏感性的原因。我們通過FCM分析發(fā)現(xiàn)，PKHhi細胞高表達IFN-γR1與IFN-γR2，而PKHlow及PKHneg細胞的表達量則較低。接下來我們通過蛋白質(zhì)免疫印跡及激光共聚焦實驗證明了在IFN-γ作用下，PKHhi細胞中IFN-γ誘導的凋亡相關(guān)通路高度激活;對細

17、胞IFN-γR進行抗體阻斷后，IFN-γ對PKHhi與其他細胞亞群的殺傷差異明顯減弱。上述結(jié)果說明QCCSC特異性高表達IFN-γR從而導致了其對IFN-γ誘導凋亡的高敏感性。
　　5.靜息大腸癌干細胞低表達miR-4666-3p。
　　大量證據(jù)表明表觀遺傳學調(diào)控對CSC的增殖、分化等存在明顯影響。因此在上述結(jié)論基礎(chǔ)上，我們試圖從microRNA的層面探索QCCSC與其他亞群細胞間存在IFN-γR表達差異的原因或上游機制。我

18、們應(yīng)用miRNA芯片研究發(fā)現(xiàn)QCCSC與普通大腸癌腫瘤細胞間的miRNA表達譜具有明顯差異，其中miR-4666-3p在PKHhi細胞中明顯低表達，提示miR-4666-3p可能為抑癌基因。對miR-4666-3p靶基因進行KEGG信號通路聚類分析，發(fā)現(xiàn)其具有潛在抑制大腸癌CSC特征的可能性。同時我們通過生物信息學分析預(yù)測IFN-γR1/2為miR-4666-3p靶基因。我們證實IFN-γR1/2mRNA3'端非翻譯區(qū)包含miR-466

19、6-3p的保守結(jié)合位點，熒光素雙報告基因系統(tǒng)檢測示miR-4666-3p可引起miRNA靶基因報告載體熒光強度的明顯改變。且大腸癌細胞中轉(zhuǎn)染miR-4666-3p后，IFN-γR1/2表達均明顯下調(diào)。
　　6.miR-4666-3p抑制靜息大腸癌腫瘤干細胞的自我更新，促進其分化。
　　慢病毒感染成功建立miR-4666-3p大腸癌細胞高表達/抑制的穩(wěn)定細胞系以驗證其生物學功能。體外實驗證實miR-4666-3p能明顯抑制QC

20、CSC的連續(xù)克隆球形成能力，增強奧沙利鉑敏感性，同時使得干細胞相關(guān)基因(KLF4，OCT4，NANOG,SOX2)表達降低，上皮細胞分化標志E-caderin，Pan-karetin表達增加;裸鼠體內(nèi)連續(xù)成瘤實驗證實miR-4666-3p具有抑瘤作用。以上結(jié)果均表明miR-4666-3p具有抑癌作用，提示其可成為潛在的治療靶點或抗癌藥物。
　　研究結(jié)論：
　　QCCSC是一個獨立的腫瘤干細胞亞群，是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)的根源。我們

21、通過PKH細胞膜染色結(jié)合無血清克隆球培養(yǎng)分離出靜息大腸癌細胞，通過一系列實驗證明其具有相對靜息及CSC的特性。同時還率先發(fā)現(xiàn)QCCSC高表達IFN-γR導致其可以被IFN-γ選擇性殺傷。在其上游機制研究中，我們首次報道m(xù)iR-4666-3p低表達于QCCSC（PKHhi細胞），且IFN-γR1/2均為其功能靶基因。此外，我們發(fā)現(xiàn)miR-4666-3p具有抑制QCCSC自我更新，促進其分化的作用。本研究不僅豐富了大腸癌干細胞調(diào)控機制理論，