靶向性雙自殺基因治療載體的構建及其對大腸癌細胞的殺傷作用.pdf

1、目的： 構建由癌胚抗原啟動子(CEA promoter，Cp)驅動的雙自殺基因CD-TK治療載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK，研究癌胚抗原啟動子能否控制CD-TK基因在CEA陽性大腸癌細胞中專一性表達和殺傷，比較融合基因與單基因對腫瘤細胞生長抑制方面有無差異，是否存在協(xié)同效應，并確定安全有效的藥物使用濃度。觀察旁觀者效應。 方法： 分別以提取的人血細胞基因組DNA，pMD18-CD質粒和tgCMV/Hy

2、-TK質粒為模板，PCR擴增Cp、CD和TK基因片段，采用雙酶切、連接等方法依次將Cp、CD、TK基因亞克隆到載體pcDNA3.1(-)，構建含Cp啟動子和CD-TK融合基因的載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK。 將靶向性載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK通過脂質體介導的方法分別轉染CEA陽性的人大腸癌SW480細胞和CEA陰性的Hela細胞，采用RT-PCR檢測在CEA啟動子的調控下CD-TK融合基因分別在CE

3、A陽性的人大腸癌SW480細胞和CEA陰性的Hela細胞的表達情況。并通過MTT法測定給予藥物作用后雙自殺基因對SW480細胞和Hela細胞的殺傷效應，以觀察由CEA啟動子驅動的CD-TK基因在CEA陽性細胞和陰性細胞中的細胞毒作用。 單獨或聯(lián)合給藥GCV和/或5-Fc，在不同濃度的藥物作用后，MTT法測定雙自殺基因對SW480細胞的體外殺傷效應，比較融合基因與單基因對腫瘤細胞生長抑制方面有無差異，是否存在協(xié)同效應，并確定安全有

4、效的藥物使用濃度。以不同比例混合轉染與未轉染細胞，加藥處理，用MTT法檢測藥物對SW480細胞的抑制率，以觀察旁觀者效應。 結果： 1.519bp的Cp基因片段、1310bp的CD基因片段、1129bp的TK基因均克隆正確。 2.靶向性基因治療載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK經凝膠電泳和DNA測序證實構建正確。 3.轉染了靶向性載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的SW480細胞經過RT-

5、PCR鑒定證實有CD-TK基因的表達，CEA陰性Hela細胞則沒有CD-TK基因的表達。 4.在細胞培養(yǎng)試驗中，轉染了靶向性載體pcDNA3.1(-)Cp-cD-TK的SW480細胞對前藥5-Fc和GCV敏感。單獨用前體藥物處理轉染載體的細胞SW480，在GCV，5-Fc濃度分別為1μg/mL，160μg/mL時，對SW480細胞的生長抑制率分別為32.33％和31.54％(P<0.01)。二者聯(lián)合使用對SW480細胞的生長抑制

6、效果更為顯著，生長抑制率達60.70％(P<0.01)。 5.用前體藥物處理部分轉染的SW480細胞可見旁觀者效應，當轉染與未轉染的SW480細胞的混合比例為50％時，即表現(xiàn)出顯著的旁觀者效應。而聯(lián)合用藥的旁觀者效應較單獨用藥則更為明顯(39.28％，P<0.01)。 結論： 正確構建了靶向性基因治療載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK。CEA啟動子能控制CD-TK基因在CEA陽性大腸癌細胞中專一性表達和殺