靶向性雙自殺基因治療載體的構(gòu)建及其對大腸癌細(xì)胞的殺傷作用.pdf

1、目的： 構(gòu)建由癌胚抗原啟動子(CEA promoter，Cp)驅(qū)動的雙自殺基因CD-TK治療載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK，研究癌胚抗原啟動子能否控制CD-TK基因在CEA陽性大腸癌細(xì)胞中專一性表達(dá)和殺傷，比較融合基因與單基因?qū)δ[瘤細(xì)胞生長抑制方面有無差異，是否存在協(xié)同效應(yīng)，并確定安全有效的藥物使用濃度。觀察旁觀者效應(yīng)。 方法： 分別以提取的人血細(xì)胞基因組DNA，pMD18-CD質(zhì)粒和tgCMV/Hy

2、-TK質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增Cp、CD和TK基因片段，采用雙酶切、連接等方法依次將Cp、CD、TK基因亞克隆到載體pcDNA3.1(-)，構(gòu)建含Cp啟動子和CD-TK融合基因的載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK。 將靶向性載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)染CEA陽性的人大腸癌SW480細(xì)胞和CEA陰性的Hela細(xì)胞，采用RT-PCR檢測在CEA啟動子的調(diào)控下CD-TK融合基因分別在CE

3、A陽性的人大腸癌SW480細(xì)胞和CEA陰性的Hela細(xì)胞的表達(dá)情況。并通過MTT法測定給予藥物作用后雙自殺基因?qū)W480細(xì)胞和Hela細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，以觀察由CEA啟動子驅(qū)動的CD-TK基因在CEA陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞中的細(xì)胞毒作用。 單獨(dú)或聯(lián)合給藥GCV和/或5-Fc，在不同濃度的藥物作用后，MTT法測定雙自殺基因?qū)W480細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)，比較融合基因與單基因?qū)δ[瘤細(xì)胞生長抑制方面有無差異，是否存在協(xié)同效應(yīng)，并確定安全有

4、效的藥物使用濃度。以不同比例混合轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加藥處理，用MTT法檢測藥物對SW480細(xì)胞的抑制率，以觀察旁觀者效應(yīng)。 結(jié)果： 1.519bp的Cp基因片段、1310bp的CD基因片段、1129bp的TK基因均克隆正確。 2.靶向性基因治療載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK經(jīng)凝膠電泳和DNA測序證實構(gòu)建正確。 3.轉(zhuǎn)染了靶向性載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的SW480細(xì)胞經(jīng)過RT-

5、PCR鑒定證實有CD-TK基因的表達(dá)，CEA陰性Hela細(xì)胞則沒有CD-TK基因的表達(dá)。 4.在細(xì)胞培養(yǎng)試驗中，轉(zhuǎn)染了靶向性載體pcDNA3.1(-)Cp-cD-TK的SW480細(xì)胞對前藥5-Fc和GCV敏感。單獨(dú)用前體藥物處理轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞SW480，在GCV，5-Fc濃度分別為1μg/mL，160μg/mL時，對SW480細(xì)胞的生長抑制率分別為32.33％和31.54％(P<0.01)。二者聯(lián)合使用對SW480細(xì)胞的生長抑制

6、效果更為顯著，生長抑制率達(dá)60.70％(P<0.01)。 5.用前體藥物處理部分轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞可見旁觀者效應(yīng)，當(dāng)轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞的混合比例為50％時，即表現(xiàn)出顯著的旁觀者效應(yīng)。而聯(lián)合用藥的旁觀者效應(yīng)較單獨(dú)用藥則更為明顯(39.28％，P<0.01)。 結(jié)論： 正確構(gòu)建了靶向性基因治療載體pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK。CEA啟動子能控制CD-TK基因在CEA陽性大腸癌細(xì)胞中專一性表達(dá)和殺