2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、第一部分、前列腺特異性的雙基因重組質(zhì)粒pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43的構(gòu)建及鑒定
   目的:構(gòu)建前列腺特異性的雙基因重組質(zhì)粒pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43,為前列腺癌的基因治療實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
   方法:獲取Cx43基因并克隆至pMD19-T Simple質(zhì)粒;合成HSV-TK基因并克隆到pIRES的MCS A中,得pIRES-TK;獲取PSMAe/p并克隆至pIRES-TK中替換CMV啟動(dòng)

2、子,得pIRES-PSMAe/p-TK;將Cx43基因克隆到pIRES-PSMAe/p-TK的MCS B中,得pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43,對(duì)此質(zhì)粒雙酶切鑒定并測(cè)序;pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP,RT-PCR觀察TK及Cx43基因的表達(dá)。
   結(jié)果:合成的各質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)目的基因條帶;pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43經(jīng)序與預(yù)期設(shè)計(jì)相符;pIR

3、ES-PSMAe/p-TK-Cx43轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞,RT-PCR顯示HSV-TK及Cx43基因的mRNA成功表達(dá)。
   結(jié)論:成功構(gòu)建了前列腺特異性的含HSV-TK及Cx43的雙基因重組質(zhì)粒pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43。
   第二部分、PAMAM-D載雙靶向自殺基因系統(tǒng)對(duì)前列腺癌細(xì)胞系LNCaP殺傷作用的體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
   目的:建立一種新型的非病毒載體自殺基因輸送、表達(dá)體系,并探討其

4、對(duì)前列腺癌細(xì)胞系LNCaP的殺傷效果。
   方法:(1)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):將G5-PAMAM-D-fol和G5-PAMAM-D兩種載體材料與pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43、pIRES-PSMAe/p-TK、pIRES-TK三種不同質(zhì)?;旌戏謩e轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞,共分10組,按分組情況給予GCV及吉西他濱。各組行RT-PCR及Western blot檢測(cè)HSV-TK與Cx43基因的表達(dá),轉(zhuǎn)染24h后以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

5、情況,應(yīng)用Annexin V-FITC試劑染色后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。(2)原位基因治療動(dòng)物實(shí)驗(yàn):用LNCaP細(xì)胞制備前列腺癌皮下荷瘤鼠模型,共分8組,按分組情況給予GCV及吉西他濱,觀察整個(gè)治療過(guò)程中腫瘤的體積以及治療結(jié)束后的腫瘤重量,并取出腫瘤行病理學(xué)檢查及Western blot檢測(cè)HSV-TK及Cx43表達(dá)。
   結(jié)果:(1)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):①RT-PCR及Western blot檢測(cè)顯示A、B、C、D、E、F組

6、均有TK基因的表達(dá),A、B兩組還有Cx43基因表達(dá),而G、H、I、J組均未見(jiàn)此兩種基因的的表達(dá)。②MTT檢測(cè)顯示:I組和J組相比,兩組的OD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);A-H組的OD值均明顯小于I組和J組(P<0.05),其中G組和H組相比,兩組的OD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05):在GCV濃度很低時(shí)(0.1μg/ml和1μg/ml):A-F組與G、H組相比,P值均大于0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而自GCV濃度達(dá)到5μg/ml起,A-F

7、組OD值均明顯小于G、H組(P<0.05);A-F組任意兩組之間的OD值比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞抑制率圖反映出:隨著GCV濃度的增加,A-F組的LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率亦增加,體現(xiàn)出明顯的劑量依賴性,且以A組的趨勢(shì)最為明顯;而G、H組對(duì)細(xì)胞的抑制作用并未體現(xiàn)出隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)的趨勢(shì),且對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率處于較低的水平;I組幾乎對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。③凋亡染色流式細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示:A組細(xì)胞的早期凋亡率為15.02±0.

8、39%,明顯高于其它各組(P<0.05);I組和J組早期細(xì)胞凋亡率相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),G組和H組相比早期凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但G、H組與I、J組相比,早期凋亡率要高(P<0.05);B-F各組細(xì)胞早期凋亡率明顯高于G、H、I、J組(P<0.05),且B-F各組之間的早期凋亡率相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。(2)原位基因治療動(dòng)物實(shí)驗(yàn):①第一組至第四組(材料與質(zhì)?;旌限D(zhuǎn)染治療組)與第五至第八組(不同的對(duì)照

9、組)相比,在整個(gè)治療過(guò)程中腫瘤體積均明顯減小(P<0.05),特別是在治療的前兩個(gè)周期,腫瘤的生長(zhǎng)更為緩慢,但隨著腫瘤體積增大,抑瘤效果降低;第一組至第四組組間相比,腫瘤體積差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且第一組腫瘤體積最小。②治療結(jié)束后,四個(gè)治療組與四個(gè)對(duì)照組相比,腫瘤重量明顯較輕(P<0.05);治療組組間比較,除了第二組與第四組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以外(P>0.05),各組間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);而四個(gè)對(duì)照組組間相

10、比統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差別(P>0.05)。③取腫瘤組織行Western blot檢測(cè),第一組至第四組有TK表達(dá),而第一組和第二組還有Cx43表達(dá)。④腫瘤組織行病理檢查顯示治療組對(duì)腫瘤有明顯的殺傷作用。
   結(jié)論:G5-PAMAM-D-fol作為非病毒基因載體對(duì)前列腺癌細(xì)胞系LNCaP靶向性強(qiáng)且毒性較低;重組質(zhì)粒pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43可靶向轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系LNCaP并成功表達(dá)目的基因,Cx43及吉西他濱均可增強(qiáng)HS

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