CD-TK融合雙自殺基因聯(lián)合GEN治療前列腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的 前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是美國(guó)男性發(fā)病率極高的惡性腫瘤，僅次于肺癌而位于第二位。據(jù)報(bào)道到2005年新發(fā)病例達(dá)232090例，而死亡率達(dá)30350例。在我國(guó)發(fā)病率較美國(guó)要低，但最近幾年，隨著亞洲及我國(guó)人民飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整、人口老齡化及醫(yī)療檢測(cè)技術(shù)水平的提高，前列腺癌的發(fā)病呈逐年上升趨勢(shì)。雖然早期前列腺癌的治療可采用根治性前列腺切除術(shù)、放療、冷凍療法等，但存在尿失禁和勃起功能障礙等副作用，而且

2、治療后腫瘤仍有復(fù)發(fā)可能，晚期前列腺癌尚未有令人滿意的治療手段。 CD基因編碼大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶，能將對(duì)細(xì)胞無(wú)毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為有細(xì)胞毒性的代謝產(chǎn)物5-氟尿嘧啶，從而抑制脫氧核苷合成酶和細(xì)胞DNA合成而殺死細(xì)胞。HSV-TK基因編碼單純皰疹病毒胸苷激酶，能將藥物前體如丙氧鳥苷磷酸化，抑制細(xì)胞DNA聚合酶或作為其底物摻入到DNA合成鏈中，使細(xì)胞的DNA合成終止從而殺死細(xì)胞。國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒介導(dǎo)TK/GCV和

3、CD/5-FC自殺基因系統(tǒng)進(jìn)行了各種腫瘤的治療研究，作用效果明顯。國(guó)內(nèi)外有報(bào)道表明CD-TK融合雙自殺基因療法在前列腺癌的治療方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性。但是目前基因療效尚未取得令人滿意的效果，主要原因之一是目的基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞效率低下，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)藥物相互作用尚有一定的差距。 大豆提取物染料木黃酮(genistein，GEN)是異黃酮類化合物，其化學(xué)名為4，5，7-三羥黃酮，廣泛存在于包括大豆在內(nèi)的多種蔬菜和水果中。它是非特

4、異性酪氨酸蛋白激酶(PTK)抑制劑，對(duì)多種腫瘤的增殖有抑制作用。GEN能明顯誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡從而殺傷細(xì)胞，應(yīng)用GEN能對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。GEN給藥途徑一般是口服，在消化吸收的過(guò)程中會(huì)代謝消耗部分，最后到達(dá)腫瘤的藥量很難準(zhǔn)確控制。迄今尚未見(jiàn)到兩者聯(lián)合應(yīng)用的報(bào)道，GEN能否提高CD-TK雙融合自殺基因系統(tǒng)的治療效果目前尚不清楚。 本研究嘗試采用CD-TK雙融合自殺基因聯(lián)合GEN(genistein)，對(duì)前列腺癌細(xì)胞株

5、RM-1進(jìn)行體內(nèi)外治療研究，探討兩者聯(lián)合應(yīng)用的治療效果，為前列腺癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1、用含有大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)和單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的復(fù)制缺陷腺病毒感染293細(xì)胞，擴(kuò)增腺病毒。超速離心純化腺病毒，用綠色熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定腺病毒滴度。 2、用攜帶有CD-TK的腺病毒作載體感染RM-1細(xì)胞，獲取含CD-TK基因的RM-1細(xì)胞。分別提取未感染以及感染腺

6、病毒的RM-1細(xì)胞的RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，電泳鑒定測(cè)定CD-TK mRNA的表達(dá)。 3、體外培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)染CD-TK基因的RM-1細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度GCV、5-FC、GEN，GCV濃度為0.0125μg/ml、0.125μg/ml、1.25μg/ml、12.5μg/ml、125μg/ml、1250μg/ml，5-FC濃度為10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/m

7、l、320μg/ml，GEN濃度為3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，MTT法測(cè)定各組細(xì)胞存活率。 4、雄性C57BL/6鼠30只，皮下注射濃度為1×10<'7>/ml RM-1細(xì)胞PBS懸液0.1 ml，選取腫瘤大小約80 mm<'3>鼠24只，隨機(jī)分成4N，每組6只，第1組為對(duì)照組：RM-1(注射PBS)；第2組為GEN組：RM-1/GEN(無(wú)腺病毒

8、注射組)；第3組為腺病毒；0HGCV+5-FC治療組(Adv+GCV+5-FC)：RM-1/(Adv+GCV+5-FC)；第4組為聯(lián)合治療組：RM-1/(Adv+GCV+5-FC+GEN)。第3-4組分別進(jìn)行瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射腺病毒，每次100μl，每天1次，連續(xù)3 d，第1-2組僅在瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射PBS每次100μl，每天1次，連續(xù)3 d。從第4天開(kāi)始治療組(3-4組)腹腔內(nèi)注射GCV和5-FC，GCV 100 mg·kg<'-1>，5-

9、FC 300 mg·kg<'-1>，第2組腹腔內(nèi)注射GEN33.3 mg．kg<'-1>，第1組腹腔內(nèi)注射PBS 100μl，連續(xù)10 d。之后再觀察2 d結(jié)束實(shí)驗(yàn)，測(cè)量各鼠腫瘤大小，取出各組鼠腫瘤進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。用免疫組織化學(xué)S-P法對(duì)4組前列腺癌組織切片行bcl-2的免疫組化染色，采用人工閱片判斷前列腺癌組織bcl-2的染色程度。5、應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，以P<0.05為具

10、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)志。 結(jié)果 1、293細(xì)胞能大量擴(kuò)增腺病毒，純化后腺病毒滴度可達(dá)1.58×10<'10>PFU/ml。 2、經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增感染腺病毒的RM-1細(xì)胞出現(xiàn)大小為233bp的CD基因片段和234bp的TK基因片段，而未感染腺病毒的RM-1細(xì)胞未出現(xiàn)相應(yīng)片段，表明感染腺病毒的RM-1細(xì)胞中有CD和TK基因mRNA表達(dá)。 3、當(dāng)GCV為12.5μg/ml以及5-FC為80μg/ml時(shí)，細(xì)胞絕大部

11、分存活；當(dāng)GCV為125μg/ml以及5-FC為160μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降；當(dāng)GCV為1250μg/ml以及5-FC為320μg/ml時(shí)，細(xì)胞幾乎都凋亡。當(dāng)GCV、5-FC聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，抑制率明顯增加。在相應(yīng)各種前藥濃度下，雙基因組與單基因組差異有顯著性(P<0.05)。 4、當(dāng)GEN濃度小于50μg/ml且單獨(dú)應(yīng)用時(shí)時(shí)，RM-1細(xì)胞的存活率維持在80％以上，殺傷作用不是很明顯。蛤當(dāng)CD-TK基因和GEN兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)

12、，RM-1細(xì)胞的存活率維持在15％以下，聯(lián)合組與單獨(dú)用GEN組相比較有明顯差異(P=0.00)。也就是說(shuō)，在聯(lián)合治療組中CD-TK雙基因殺傷RM-1細(xì)胞，僅加用極微量GEN就達(dá)到理想殺傷效果。 5、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組鼠腫瘤體積為1008.73±126.73 mm<'3>，單用雙基因、GEN組的腫瘤體積分別為222.60±26.79 mm<'3>、359.06±53.17mm<'3>，這兩組體積明顯小于對(duì)照組(P=0.00)。而

13、聯(lián)合治療組腫瘤體積為25.31±9.24 mm<'3>，明顯小于前面3組(P=0.00)。6、組織病理學(xué)HE染色見(jiàn)治療組均出現(xiàn)細(xì)胞壞死凋亡，基因組治療效果比GEN好，其中以聯(lián)合應(yīng)用組最為明顯，僅于周邊見(jiàn)少量活腫瘤細(xì)胞。 7、超高敏SP免疫組化法檢測(cè)bcl-2的表達(dá)，見(jiàn)PBS組呈強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：GEN組介乎強(qiáng)陽(yáng)性與中度陽(yáng)之間；基因組為中度陽(yáng)性(++)；聯(lián)合治療組呈弱陽(yáng)性(+)。 結(jié)論 1、腺病毒載體能有效地將胞嘧

14、啶脫氨酶和胸苷激酶(CD-TK)融合雙自殺基因?qū)肭傲邢侔㏑M-1細(xì)胞中表達(dá)。 2、CD-TK融合自殺基因聯(lián)合應(yīng)用在體外對(duì)RM-1前列腺癌細(xì)胞有協(xié)同殺傷作用，療效優(yōu)于單一自殺基因。 3、GEN對(duì)RM-1細(xì)胞有一定得抑制作用，且能增強(qiáng)CD-TK融合自殺基因系統(tǒng)對(duì)RM-1的殺傷作用。 4、CD-TK融合自殺基因能明顯抑制鼠體內(nèi)前列腺癌的生長(zhǎng)，且效果優(yōu)于GEN，而兩者聯(lián)合應(yīng)用效果最好，GEN能增強(qiáng)CD-TK融合自殺基因