KDR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CD-TK雙自殺基因?qū)Ω伟┘?xì)胞靶向治療的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景: 腫瘤自殺基因療法是近年來腫瘤基因治療中一個(gè)重要的研究策略，尤其是自殺基因的選擇與重組，載體系統(tǒng)的優(yōu)化，基因的靶向性轉(zhuǎn)移表達(dá)，以及自殺基因的聯(lián)合治療等均有助于提高自殺基因特異性表達(dá)，增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。 腫瘤自殺基因治療是將自殺基因?qū)肽[瘤靶細(xì)胞并使之表達(dá)?；蚓幋a的酶將無毒的藥物前體轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的代謝物，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還通過旁觀者作用殺傷鄰近未轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞。目前研究最多的且被美國(guó)FDA批準(zhǔn)

2、應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的自殺基因系統(tǒng)主要有單純皰疹病毒I型胸苷激酶/丙氧鳥苷系統(tǒng)(HSV—TK/GCV)和胞嘧啶脫氨酶/5—氟胞嘧啶系統(tǒng)(CD/5—FC)。此兩系統(tǒng)的抗腫瘤效能已在多種腫瘤的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。鑒于不同類型腫瘤細(xì)胞對(duì)自殺基因系統(tǒng)的敏感性不同、單一自殺基因系統(tǒng)治療時(shí)部分腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥以及CD/5—FC和HSV—TK/GCV系統(tǒng)的作用機(jī)理具有很強(qiáng)的互補(bǔ)性，聯(lián)合應(yīng)用此兩系統(tǒng)不僅可以提高腫瘤細(xì)胞殺傷作用，改善治療效果，而且可以擴(kuò)大

3、腫瘤治療譜，減少耐藥現(xiàn)象發(fā)生。 眾所周知，腫瘤的自殺基因治療雖已成為基因治療中研究熱點(diǎn)之一，但目的基因的靶向性及基因轉(zhuǎn)移的低效率是這一療法廣泛開展的主要障礙。如能使自殺基因選擇性地作用于腫瘤細(xì)胞而不在正常細(xì)胞中表達(dá)，將能使該治療策略更加完善。而絕大多數(shù)惡性實(shí)體瘤的生物學(xué)特性為生長(zhǎng)迅速，致使其滋養(yǎng)血管不能及時(shí)供應(yīng)所有腫瘤細(xì)胞，該特點(diǎn)使前體藥物難以接近所有腫瘤細(xì)胞。選擇一合適啟動(dòng)子既靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，又靶向腫瘤細(xì)胞，如此既可殺傷

4、腫瘤細(xì)胞，又可靶向破壞腫瘤滋養(yǎng)血管使得其灌流區(qū)大量腫瘤細(xì)胞缺血性壞死，從而達(dá)到雙重靶向治療作用。大量研究證明，KDR在正常人體組織中呈低水平表達(dá)，而在絕大多數(shù)腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，且KDR不僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，還表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，其表達(dá)水平與血管內(nèi)皮細(xì)胞更新速度及腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。因此，將KDR作為靶點(diǎn)，可為診斷和治療腫瘤提供新的理論依據(jù)。基于上述研究，為彌補(bǔ)單自殺基因的不足、克服以往啟動(dòng)子僅適用于某一腫瘤細(xì)胞的缺點(diǎn)、并利用腺病毒載體的

5、優(yōu)勢(shì)，本課題設(shè)計(jì)思路如下：應(yīng)用腺病毒載體構(gòu)建KDR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CD/TK雙自殺基因的重組腺病毒，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞BEL—7402，觀察該治療系統(tǒng)的體外殺傷作用，為重組腺病毒介導(dǎo)KDR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CD/TK雙自殺基因靶向治療肝癌的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的: 研究腺病毒介導(dǎo)的KDR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)肝癌細(xì)胞選擇性殺傷作用，并為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。首先利用腺病毒載體構(gòu)建攜帶KDR啟動(dòng)子調(diào)控的雙自殺基因重組

6、腺病毒，將所構(gòu)建的重組腺病毒轉(zhuǎn)染BEL—7402細(xì)胞，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞施以前藥(5—FC和/或GCV)，觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)前藥的敏感性。 方法: 一、重組腺病毒的構(gòu)建應(yīng)用PCR擴(kuò)增出KDR啟動(dòng)子、CD基因、TK基因序列，亞克隆入中間載體pcDNh3構(gòu)建pcDNA3KDRP—CDglyTK，然后酶切KDRP—CDglyTK—pA片斷，插入到穿梭質(zhì)粒padtrack上構(gòu)建padtrackKDRP—C

7、DglyTK質(zhì)粒；最后應(yīng)用Adeasy-1系統(tǒng)，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組“兩步轉(zhuǎn)化法”構(gòu)建攜帶KDR啟動(dòng)子調(diào)控下的CD與TK的雙自殺基因腺病毒重組質(zhì)粒pAdEasyKDRP—CDglyTK。重組質(zhì)粒在293細(xì)胞中包裝成病毒，并進(jìn)一步擴(kuò)增、純化，通過熒光顯微鏡下293細(xì)胞中綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)觀察重組病毒的包裝與復(fù)制，并以PCR方法鑒定重組腺病毒。 二、腺病毒介導(dǎo)的KDRP—CDglyTK雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)BEL—7402細(xì)胞的體

8、外殺傷作用用重組腺病毒AdKDRP—CDglyTK轉(zhuǎn)染BEL—7402細(xì)胞及LS174T細(xì)胞(對(duì)照)，檢測(cè)目的基因的表達(dá)。在前藥5—氟胞嘧啶(5—FC)和/或更昔洛韋(GCV)作用下，測(cè)定腫瘤細(xì)胞的存活率，觀察旁觀者效應(yīng)。 結(jié)果: 一、所得病毒滴度為2.5×1012pfu/ml。兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率相似，其轉(zhuǎn)染率隨腺病毒滴度的遞增而增加。 二、RT—PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染AdKDR—CDglyTK的BEL—7402

9、有目的基因CDglyTK的表達(dá)，轉(zhuǎn)染AdKDR—CDglyTK的LS174T細(xì)胞無目的基因表達(dá)。表達(dá)KDRBEL—7402細(xì)胞對(duì)前藥具有較高的敏感性，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的存活率隨前藥濃度的增加而遞減。BEL—7402細(xì)胞單用前藥5—0FC(160mg/L)或GCV(100mg/L)，與二者聯(lián)合用藥(5—FC=160mg/L，GCV=100mg/L)相比，生存率有顯著性差異(F=869.667，P=0.000)，提示聯(lián)合用藥比單一用藥對(duì)BEL—7

10、402細(xì)胞有較強(qiáng)殺傷效應(yīng)。而LS174T細(xì)胞單用前藥5—FC或GCV，與二者聯(lián)合用藥相比，生存率無顯著性差異(F=1.770，P=0.186)，提示重組腺病毒對(duì)不表達(dá)KDR的LS174T細(xì)胞選擇性殺傷作用。將轉(zhuǎn)染腺病毒的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞以不同比例混合培養(yǎng)，觀察到該體系明顯的旁觀者效應(yīng)。 結(jié)論: 一、重組腺病毒對(duì)BEL—7402細(xì)胞及LS174T細(xì)胞均具有較高的轉(zhuǎn)染率，且對(duì)二者轉(zhuǎn)染率相似； 二、重組腺病毒能將KDR